蛋白质折叠—去折叠过程中间体的实验研究

《蛋白质折叠—去折叠过程中间体的实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要中文摘要论文题目：蛋白质折叠．去折叠过程中间体的实验研究博士研究生：瞿鹏导师姓名：陆祖宏(教授)学校名称：东南大学在蛋白质变性和复性过程中，存在着许多局部能量最小的中间体。中间体蛋白质分子通过缔合作用形成二聚体、多聚体最终形成沉淀，影响蛋白质的复性。可以通过折叠添加剂降低错误折叠蛋白质的稳定性，增加折叠中间体的溶解性。因此，蛋白质折叠机制的阐明存在着重要的理论意义和潜在的应用前景：(1)通过研究各种因素对蛋白质结构的影响，可以高产率、高活性得获得各种蛋白质产品；(2)通过研究维系蛋白质分子结构的各种次级键，通过蛋白质折叠机制的阐明，可以将DNA重组和多肽合成技术得到的

2、多肽链按照意愿设计出具有特定功能的蛋白质；(3)可以认识由蛋白质错误折叠引起的各种疾病的致病机理，寻找到有效的治疗方案；(4)加快蛋白质结构解析的步伐；(5)研究蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等。本文以牛血清蛋白和胰蛋白酶为研究对象开展研究。研究了它们在变性和复性过程中出现的中间体；研究了多种因素对中间体结构的影响；也研究了化学变性剂和药物小分子对蛋白质分子结构的影响。具体内容如下：1．光谱法研究碱诱导变性牛血清蛋白中间体用近紫外、远紫外CD光谱、内源荧光光谱、ANS荧光光谱法发现和表征了牛血清蛋白(BSA)的碱诱导变性pH11．2中间体。“相图分析”进一步证实了该中间体

3、的存在。结果显示这是一个熔融球中间体，三级结构被严重波坏，二级结构还大量存在。中间体上还具有～定的疏水结合位点，因此具有相当强的ANS荧光。我们认为，该中间体的形成是由于强碱性溶剂改变了蛋白质分子内带电氨基酸的电离平衡，引起蛋白质分子内的近程作用力增强，远程作用力减弱。所以，从整体上看，整个蛋白质分子的结构伸展了，然而，BSA分子的局部结构变得更加紧密。通过对熔融球中间体的表征，有利于加深认识维持蛋白质三维结构的各种作用力，也有利于发现存在于熔融球和天然态以及熔融球和变性态之间可能存在的中间体蛋白。2．盐酸胍诱导的胰蛋白酶折叠一去折叠过程中部分折叠中间体的研究用近紫外和远紫外

4、CD光谱、内源荧光光谱(荧光强度、最大发射波长、色氨酸荧光偏振)和外源ANS荧光等多种物理化学手段研究了盐酸胍诱导的猪胰蛋白酶的变性和复性过东南大学博士学位论文程。发现了两种变性中问体。用“相图”的方法进一步证实了这两种中间体的存在。在盐酸胍诱导的猪胰蛋白酶的变性过程中至少存在两个中间体。首先，在～1．8M盐酸胍处，胰蛋白酶转化成一个分子内移动性较低的熔融球。在此状态下，蛋白质分子没有了三级结构，二级结构部分消失。色氨酸周围的微环境变化很小。检测不到明显的ANS荧光。在～3．9M盐酸胍处，胰蛋白酶转化到一个前熔融球状态。转化后，蛋白质分子的三级结构完全消失，二级结构也大部分消

5、失。内源荧光发生明显的红移，荧光偏振度降低。当盐酸胍的浓度大于4．0M时，胰蛋白酶完全变性。3．光谱技术研究6一巯基鸟嘌呤和牛血清蛋白之间的相互作用用紫外吸收光谱、CD光谱和荧光光谱研究了6一巯基鸟嘌呤(6．TG)和BSA之问的相互作用。6-TG对BSA的熄灭是静态熄灭过程。用荧光熄灭方法计算出T-者之间的结合位点数和结合常数。热力学参数，埘o，AGo和丛o，指示6-TG和BSA之间的作用是熵驱动的，疏水作用力在结合过程中发挥着最重要的作用。根据Forster无辐射能量转移理论，供体(BSA)矛n受体(6．TG)之间的距离被估算。同步荧光光谱显示6．TG结合到BSA上后，蛋白

6、质中色氨酸周围的极性升高，疏水性降低。荧光熄灭主要来源于色氨酸荧光而是不是酪氨酸荧光。CD光谱显示，随着6．TG结合牛血清蛋白，蛋白质分子中的a．螺旋含量逐渐降低。6-TG和BSA结合后，CD光谱的形状并没有发生大的变化，说明该药物分子结合在BSA上后，蛋白质分子的二级机构依然以0【．螺旋为主。4．脲和盐酸胍对6一巯基鸟嘌呤和牛血清蛋白相互作用的影响用荧光光谱的方法研究了脲和盐酸胍存在和不存在两种情况下6-TG和BSA之间的相互作用。天然态BSA的荧光光谱只在338nlTI处有个峰；而变性态的BSA分别在304-306nrll和348nlTl处呈现出两个波峰。后者随着变性剂浓

7、度的增加逐渐红移。BSA分子乃04和F34s的变化反映出，随着变性剂浓度的增加，酪氨酸荧光对总荧光强度的贡献越来越大。6-TG无论是对天然态的还是变性态的BSA都有熄灭作用。在变性念的BSA中，6-TG对BSA的熄灭作用主要来源于酪氨酸荧光而不是色氨酸荧光。随着变性剂浓度的升高，6-TG和BSA之间的熄灭常数和结合常数都降低。光谱分析显示，在两种变性剂环境中，6-TG对BSA都有一定的抗变性效果。随着变性剂的加入，6-TG对BSA的抗变性能力降低。5．近生理浓度的脲对核黄素与牛血清蛋白结合作用的影响用C