鸡球虫病的中药防治与DNA疫苗研究

鸡球虫病的中药防治与DNA疫苗研究

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时间:2019-05-16

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1、浙江大学动物科学学院博士学位论文鸡球虫病的中药防治与DNA疫苗研究姓名:杜爱芳申请学位级别:博士专业:动物营养与饲料科学指导教师:胡松华20040501杭州市科技局重点科研资助项目鸡球虫5401基因的克隆及其表达产物的研究与开发(项耳编号:2001112814)浙江人学博十学位论文摘要鸡球虫病是一种重要的寄生虫病,分布广,感染率高,常发生在15-50目龄的雏鸡,若不能有效控制,其现场发病率可达50%一70%,死亡率可达20%一30%,严重爆发时其死亡率可高达80%。据统计,全球养鸡业每年仅球虫病造成经济损失就达20亿英镑。目前

2、对该病的防治仍以化学合成药及抗生素为主,但由于长期应用,易产生抗药性,且在畜产品中因药物残留而影响人类的健康。鉴此,人们将目光转向非抗生索防治研究,如中药和疫苗。沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌,通过一定方法减毒后对宿主致病性显著降低,但仍保留良好的侵袭力,可携带重组质粒侵入脾和淋巴结等器官组织,并在宿主细胞中表达抗原而诱发特异性的免疫应答反应。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗已用于细菌和病毒性疾病的预防研究,但国内未见以减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫基因疫苗的相关报道。本研究目的是:1)分离鉴定杭州地区鸡球虫种类;2)用中药复方进行鸡球虫

3、病防治试验;3)克隆主要致病虫种柔嫩艾美耳球虫(£tene]la)ZJ株5401基因,构建原核和真核表达质粒,利用减毒鼠伤寒沙门氏菌基因双突变株为载体传递EteneJlaZJ株DNA疫苗,研究其免疫原性及可行性。本研究对杭州地区鸡场的球虫感染情况进行了调查,并用中药复方对实验感染球虫鸡进行防治试验。调查和防治结果表明,杭州地区主要存在3个种,即柔嫩艾美耳球虫(E据月Pl妇),毒害艾美耳球虫(£J,7poatrix)和巨型艾美耳球虫(Emaxima);中药复方煎剂对鸡柔嫩艾美耳球虫具有高效抗球虫效果,抗球虫指数(ACI)为180

4、.8;中药复方散剂具有中等抗球虫效果,ACI为178.8。应用RT-PCR扩增叵tenellazJ株5401基因。按照Oanforth(1989)发表的基因序列合成引物,引物上下游各加上EcoRI和盛lI酶切位点。PCR扩增产物约为900bp,与pGEM—T载体连接后,转化DH-5d感受态细胞,将酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序。结果表明,EtenellaZJ株5401基因序列全长为864bp,序列本身是一个开放阅读框,与Danforth等(1989)报道的基因序列的同源性为99.8%,有两个部位的碱基发生了有义突变;氨基酸序列

5、同源性为99.3%。同时将5401基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a中,构建成表达载体pET一30a一5401,用IPTG诱导该基因在EcoliBL21(DE3)中表达,诱导6h的蛋白表达量即可达到较高水平,表达量约26.3%。SDS—PAGE及Western—blot证明,融合蛋白大小约为66kDa,而非推测的38.5kDa,表明该基因可能以蛋白二聚体的形式表达。将5401基因插入真核表达载体pcDNA3,构建成真核表达质粒pcDNA3—5401,高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌(ZJili株

6、)中,并直接转染Vero细胞,提取细胞总DNA,DIG标记探针可检测到阳性杂交信号。8DS~PAGE、Western—blot可检测到31k0的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌能将5401基因呈递给Veto细胞并进行表达。将携带鸡柔嫩义美耳球虫5401基因的真核表达质粒pcDNA3—5401的减毒沙门氏菌ZJIil菌株(ZJIli/pcDNA3—5401)口服接种3日龄非免疫鸡,2周后加强免疫一次,试验过程中未见任何不良反应和鸡只死亡。二免后4周各组鸡的体重无统计学差异(P>O.05),同时肝脏和脾脏已检测不到沙门氏菌;用限制性

7、酶切分析和PCR鉴定证实,体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌zJlll菌株内比较稳定。结果提示,利用减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性和稳定性。为了探讨其免疫原性和免疫保护效果,将ZJllI/pcDNA3—5401分别以107cfu、i08cfu、i09cfu的剂量进行首免,2周后进行二免,一免后每周采血进行淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测,持续6周,测定其免疫原性。二免后一周每组随机取12羽鸡,每羽用6xi04个正tenefIaZJ株孢子化卵囊攻毒,攻虫后第8天,所有鸡称重、剖杀、取其盲肠,观察盲肠病变,对盲

8、肠内容物进行卵囊计数。结果表明:重组减毒沙门氏菌ZJliI/pcDNA3—5401株三个剂量组均能显著增强淋巴细胞增殖水平和抗体水平(P

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