黄芪多糖对大鼠心肌缺血保护作用及其机制研究

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黄芪多糖对大鼠心肌缺血保护作用及其机制研究LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMED1CARESEARCH2011VOL.22NO.4时珍国医国药2011年第22卷第4期4讨论兰科植物石斛中含联苄类,黄酮类,生物碱类,香豆素类等几大类化合物,在本课题组前期实验中发现联苄类化合物较于黄酮类,生物碱类,香豆素类化合物,表现出较强的抗血管生成活性;并基于我们实验室前期已经报道石斛中联苄类成分毛兰素(eri—anin)抗肿瘤活性主要就是通过抑制生长因子诱导的HUVEC细胞的生长'.通过实验,我们发现石斛中联苄类化合物除tris—tin外,其他化合物都能在不同程度上抑制生长因子(VEGF和bFGF)诱导人脐静脉内皮细胞的生长.联苄类化合物的化学骨架与已知微管解聚药CombretastatinA4(CA4)母核结构相似.CA4是从南非矮柳Combretumcaffrum中提取分离的一种多羟基二苯乙烯类化合物.CA4的水溶性前药CombretastatinA4磷酸盐已作为一个候选化合物被OxiGen公司开发,目前在美国和欧洲进行II期临床试验,并已获准进入美国FDA快速通道审批.因此,我们推测化学骨架——联苄有可能成为抗血管新生的药效基团.在以联苄为母核的前提下,探讨其构效关系,我们不难发现,R1一R5基团的改变和集团之间的位置改变,影响了化合物的活性.下面,我们从如下几方面阐述:首先,甲氧基为潜在的活性基团,易形成离子键,共价键,产生疏水作用,提高生物活性,erianin为此做了最好的例证;同样在其他结构完全一致的情况下,gigan.tol比batatasinIII多了甲氧基,活性明显提高了.其次,根据苯环取代基的定位效应,当甲氧基和酚羟基处于邻位时,苯环易于活 化,从而提高其活性;而当甲氧基和酚羟基处于间位时,苯环钝化,降低其活性,batatasinIII与DC一18相比,甲氧基和酚羟基位置关系由间位转变成邻位,活性明显提高.同理,当酚羟基和酚羟基处于邻位时,苯环易于活化,从而提高其活性;而当酚羟基和酚羟基处于间位时,苯环钝化,降低其活性,moscatilin与tristin相比,酚羟基和酚羟基位置关系由间位转变成邻位,活性明显提高.其三,酚羟基的钝化作用大于甲氧基,gigantol与tristin相比,由间位的甲氧基和酚羟基转换成酚羟基和酚羟基,活性作用显着性的下降.石斛中联苄类化合物moscatilin和erianin都能以较低的剂量在体外产生显着的抗血管新生的效应,对这类联苄类化合物所具有的抗血管新生的作用仍需进一步研究,以便研发具有更强选择性的抗血管新生的药物.参考文献:[1]HillenF,GriffioenAW.Tumourvaseularization:sproutingangiogene-sisandbeyond[J].CancerMetastasisRev,2007,26(3—4):489.[2]LaiWK,AdamsDH.Angiogenesisandchronicinflammation;thepo-tentialfornoveltherapeuticapproachesinchronicliverdisease[J].JHepatol,2005,42(1):7.[3]BergersG,BenjaminLE.Tumorigenesisandtheangiogenicswitch[J].NatRevCancer,2003,3(6):401.[4]CrawfordTN,AlfaroDV3rd,KerrisonJB,eta1.Diabeticretinopathyandangiogenesis[J].CurrDiabetesRev,2009,5(1):8.[5]ChuaRA,ArbiserJL.Theroleofangiogenesisinthepathogenesisofpsoriasis.Autoimmunity[J].2009,42(7):574.[6]SzekaneczZ,BesenyeiT,ParaghG,eta1.Angiogenesisinrheumatoidarthritis[J].Autoimmunity,2009,42(7):563.[7]国家药典委员会.中国药典,I部[S].北京:化学工业出版社,2005:62.[8]GongVQ,FanY,WuDZ,eta1.Invivoandinvitroevaluationoferi- 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化.结论黄芪多糖对大鼠心肌缺血有明显的保护作用,作用机制可能与其抗氧化作用有关.关键词:黄芪多糖;异丙肾上腺素;心肌缺血DOI标识:d0i:10.3969/i.issn.1008-0805.2011.04.062中图分类号:R285.5文献标识码:B文章编号:1008-0805(2011)04-0921-03收稿日期:2010-05-27;修订日期:2010.10-05基金项目:湖北省教育厅重点科研项目(No.D20092803)作者简介:闵清(1967一),女(汉族),湖北阳新人,现任成宁学院药学院教授,博士学位,主要从事中药药理学和心血管药理学研究工作.心血管疾病是当今严重威胁人类生命健康的常见病,多发病,而心肌缺血性疾病又是心血管疾病中的研究焦点.严重的心血管疾病如心肌梗塞,往往可以导致严重的后果甚至突然死亡,因此,对缺血性心血管疾病的防治一直是医学界的热点.寻找有效的抗心肌缺血天然产物尤为重要.黄芪为豆科植物膜荚黄芪?921?时珍国医国药2011年第22卷第4期LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4及蒙古黄芪的根,近年来的研究发现黄芪中含多糖,皂苷,黄酮,氨基酸等多种有效成分,其中黄芪多糖经过高科技萃取,分离而得到的,可作为免疫促进剂或调节剂,同时具有抗病毒,抗肿瘤,抗衰老,抗辐射,抗应激,抗氧化等0作用.但是黄芪多糖对心肌缺血作用及其机制的研究不多,本研究旨在用异丙肾上腺素诱发的大鼠实验性心肌缺血模型,探讨黄芪多糖对心肌缺血的保护作用及其作用机制,为其在临床上防治心肌缺血性疾病提供科学的理论依据.1材料与仪器1.1试剂黄芪多糖购于长沙绿康生物制品有限公司,血浆乳酸脱氢酶(LDH),肌酸肌酶(CK),超氧化物歧化酶(SOD),过氧化 氢酶(CAT),丙二醛(MDA),考马斯亮等测试盒均购于南京建成生物工程研究所,丹参注射液由浙江正大青春宝药业有限公司提供.其他试剂均为市售分析纯.1.2动物健康雄性sD大鼠48只,体质量(220±25)g,由咸宁学院医学实验动物中心提供(购于华中科技大学实验动物中心),合格证号:NO:00001576.1.3仪器ECG一6511型心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司),显微镜(德国莱卡DME型),TECANSUNRISE酶标仪(瑞士).2方法2.1分组健康雄性sD大鼠48只,体质量(220±25)g,随机分为6组,即正常对照组,心肌缺血模型组,丹参注射液组,黄芪多糖高剂量组,黄芪多糖中剂量组,黄芪多糖低剂量组,每组8只.2.2模型的制备黄芪多糖高,中,低剂量组分别腹腔注射黄芪多糖400,200,100mg/kg,丹参注射液组腹腔注射0.2g/kg;模型对照组,正常对照组分别腹腔注射等量的蒸馏水.每天给药1次,连续给药7d.给药第6,7天除正常对照组外,各组大鼠每天皮下多点注射异丙肾上腺素1次,每次给药剂量为10mg/kg,连续2d,制作大鼠实验性心肌缺血模型,正常对照组大鼠皮下注射等容量生理盐水.2.3心电图检测给药前测各组大鼠心电图,记录正常Ⅱ导联心电图,心电图异常者弃之.分别于第2次给异丙肾上腺素后5,10,15,20,25,30rain,测定大鼠Ⅱ导联心电图(纸速50mm/s).分析大鼠心电图S—T段的变化情况.2.4血浆的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸肌酶(CK)活力测定第2次给异丙肾上腺素后24h(即造模后24h),眼眶取血2～3ml,全血3500r/rain下离心10rain,制备血浆,4℃下冷藏,按照试剂盒说明,用酶标仪测定血浆的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸肌酶(CK)的活力. 2.5心肌缺血形态学观察取血后,快速摘取心脏标本,于冰生理盐水中充分泵出淤血后,置于冰片上用眼科剪剪去左,右心房和右心室,然后垂直其长轴水平切成两部分(靠近左心室心尖部分用于形态学观察,另一部分匀浆待测生化指标),取左心室心尖部分,置于10%甲醛溶液中固定14—18h.常规石蜡包埋,于心肌梗塞区中部沿左心室轴线每隔1mm连续切取数个5Ixm厚的切片,分别作苏木素一伊红(HE)染色,光学显微镜观察心肌细胞形态学变化.2.6心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)活力和脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量的测定在"2.5"项中取左心室的另一部分,在冰浴下制成生理盐水心肌组织匀浆,3500r/rain离心10rain,取上清液,按试剂盒说明,用TECANSUNRISE酶标仪测定SOD,CAT和MDA,考马斯亮蓝法测定蛋白含量.2.7统计学方法所有数据以面±s表示,采用SPSS11.5统计学分析软件统计处理,组间比较采用t检验和方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义,P<0.O1表示有明显统计学差异.3结果3.1黄芪多糖对心肌缺血大鼠心电图S—T段变化的影响结果(见表1).由表1可见,与正常对照组相比较,模型组大鼠体表心电图显示,S—T段显着抬高(P<0.01),说明大鼠心肌缺血模型制作成功;黄芪多糖高,中,低剂量组,丹参注射液组与模型组的心电图的sT段相比,都明显缓解了sT段的抬高(P<0.05或P<0.01),有显着性差异,高剂量黄芪多糖组与丹参注射液组效果相当,无统计学意义,黄芪多糖低,中,高剂量组之间有一定的剂量依赖性.3.2黄芪多糖对心肌缺血大鼠血浆的乳酸脱氢酶(LDH),肌酸肌酶(cK)活力的影响结果(见表2).由表2可见,与正常组比较,模型组大鼠血浆的乳酸脱氢酶(LDH),肌酸肌酶(CK)含量与明显增高(P<0.01),说明大鼠心肌细胞有损伤,大鼠心肌缺 血模型制作成功;与模型组比较,黄芪多糖,丹参注射液给药后,大鼠血浆的乳酸脱氢酶(LDH),肌酸肌酶(CK)活力都有明显的降低作用(P<0.05或P<0.O1),说明黄芪多糖与丹参组都有较好的治疗作用,黄芪多糖高剂量组效果较好,黄芪多糖高,中,低剂量有一定的剂量依赖性.3.3黄芪多糖对心肌缺血大鼠心肌组织SOD,CAT活力和NDA含量的影响结果见表3.表1黄芪多糖对心肌缺血大鼠心电图s～T段变化的影响(±s)mV与正常对照组比较,JD<O.O5,～P<O.01;与模型组比较,P<0.05,尸<0.O1;n=8表2黄芪多糖对心肌缺血大鼠血浆的乳酸脱氢酶(LDH)肌酸肌酶(CK)活力的影响(±s)与正常组比较,P<0.05,一P<0.01;与模型组比较,P<0.05,P<0.Ol:n=8?922?表3黄芪多糖对心肌缺血大鼠心肌组织SOD,CAT活力和MDA含量的影响(i±)与正常组比较,P<0.05,一P<0.O1;与模型组比较,#P<0.05,撕P<0.O1;n=8由表3可见,与正常组比较,模型组大鼠心肌组织中脂质过LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.4时珍国医国药2011年第22卷第4期氧化物丙二醛(MDA)含量增高(P<0.01),而模型组大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力明显降低(P<0.01),说明心肌缺血大鼠的抗氧化能力降低;黄芪多糖,丹参注射液腹腔给药后,明显降低模型大鼠心肌组织中脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量(P<0.05或P<0.01),明显增加模型组大鼠心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力 (P<0.05或P<0.01),黄芪多糖高剂量组效果最好,其中高剂量组的疗效与丹参注射液组相当.3.4大鼠心肌形态学变化常规石蜡包埋,HE染色后,通过光镜观察,可以发现:正常组光镜下可见心肌纤维排列整齐,横纹清晰,心肌及内膜细胞连续完整,胞核居中,胞浆着色均匀,间质无水肿,无细胞肿胀及炎性细胞浸润,未见明显的组织学改变.模型组光镜下可见心肌纤维肿胀,多处断裂,肌横纹消失,心肌问质灶性出血,空泡变性明显.血管淤血,管壁扩张,管腔增大.内膜细胞局部排列紊乱,核肿胀变圆甚至脱失,间质水肿,有较多炎细胞浸润,组织间隙明显增宽.丹参组较模型对照组改变轻微.心肌纤维轻度肿胀,局灶性断裂,少量空泡变性.内膜组织连续,间质轻度水肿,炎细胞浸润明显,组织间隙增宽.大剂量黄芪多糖组改善最明显,光镜下可见组织学轻微改变,心肌纤维排列整齐,结构尚好,未见断裂,心肌及内膜细胞排列整齐,间质轻度水肿,少量炎细胞浸润,组织间隙轻度增宽.小剂量组黄芪多糖组光镜下较模型对照组改变轻微.心肌纤维轻度肿胀,局灶性断裂,少量空泡变性.心肌及内膜细胞排列尚可,间质水肿,少量炎细胞浸润,组织间隙.中剂量组的改变介于二者之间.4讨论已有研究证实:皮下注射大剂量ISO造成的大鼠心肌梗塞样损害模型,其心电图,心肌代谢及组织病理学变化均与人类自然发生的急性心肌梗塞非常接近.ISO属于人工合成的儿茶酚胺类p肾上腺素受体激动药,可激活心肌细胞p受体,使心脏过度兴奋,心肌耗氧量增加;同激活13:受体,使冠状动脉扩张,冠脉压力下降,从而致心肌缺血,缺氧[61,ISO致大鼠心肌缺血模型是评价心肌保护药常用的心肌缺血损伤模型之一.临床心肌缺 血主要表现为ECG及酶学的异常,并以此作为实验诊断的重要依据.心电图中sT段幅度的改变(T波和J点)是反映心肌缺血损伤程度和范围的可靠指标.临床心电图分别表现为ST段呈弓背型抬高,T波倒置,血清中LDH,CK活性间接反映了心肌损伤程度,当心肌细胞缺血受损时,细胞膜通透性增加,细胞内LDH和CK外漏致血中LDH和CK升高.由实验结果可见,实验采用ISO诱发实验性心肌缺血大鼠,表现为心电图T波抬高,s—T段异常偏移,血清LDH,CK活性显着增高,表明用异丙肾上腺素诱发的大鼠心肌细胞明显受损害.与模型组相比,黄芪多糖各剂量组均可有效对抗心电图T波的异常升高,使s—T明显降低.同时血浆的LDH,CK活性显着增高,表明黄芪多糖对异丙肾上腺素诱发实验性心肌缺血大鼠有明显的保护作用.本实验光镜观察表明:黄芪多糖治疗组心肌组织未见严重病理损伤,表明黄芪多糖具有改善心肌缺血的病理结构,从而缓解心肌缺血缺氧的病理状态的作用,进一步表明黄芪多糖对实验性心肌缺血大鼠有明显的保护作用.用大剂量ISO应用能诱导心肌产生不可逆的缺血性损伤模型,其机制可能与脂质过氧化损伤,膜通透性改变,增加心肌耗氧量,心肌钙超载等因素有关J.实验结果表明,模型组大鼠心肌组织氧自由基清除剂(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性降低,脂质过氧化产物MDA含量明显增加,表明心肌缺血大鼠抗氧化能力减弱.与模型组相比,黄芪多糖各剂量组均可有效的升高SOD和CAT的活力,降低MDA含量.表明黄芪多糖对大鼠心肌缺血作用可能与抗氧化作用有关.由此可知,黄芪多糖可以降低心肌缺血大鼠的sT段异常升高,降低血浆LDH,CK活性,显着增强心肌SOD和CAT的活力,减少心肌MDA含量,提示黄芪多糖对大鼠实验性心肌缺血有明显的保护作用,其机制可能与其清除自由基,抑制脂质过氧化作用有关. 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