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1、第一章组织细胞破碎技术方法简介细胞破碎,即破坏细胞壁和细胞膜,使细胞内或亚细胞产物最大程度的释放或转移到液相。以便浸提出来进行后续的操作。捣碎机法(片型匀浆研磨法轺毐波法匀浆法(孔型匀浆法)珠磨破碎思考题1常用的细胞破碎的方法有哪些?2柯机溶剂法破碎细胞原理,常川的柯机溶剂有哪些第二章层析技术方法简介层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别(分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等),使各组分以不同程度分布在两个相,其屮一个是同定相,另一个是流动根据交换剂的属性、层析的分离的原理可将层析分类如下相,从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。分类(1)分配层析(2)离子交换

2、层析(3)凝胶过滤层析(4)亲和层析(5)吸附层析一、离子交换层析(-)棊本流程上样:洗脱:pH梯度洗脱;或离子强度梯度洗脱检测、记录分部收集。(二)离子交换分离基本原理不同氨基酸(蛋白质、酶、蛋白激素等)等电点不同,在同pH条件下带电性能不同,与交换剂结合力大小不同,结合较松的先被洗脱出来,结合较紧的后被洗脱出来,从而被分开。阳离子交换剂交换原理:RC-C1++C2*►RC-C2++CP白离子交换层析过程中的关键技术1、交换剂处理①漂洗目的是除去杂质用倾倒法除去细小颗粒(这一步一定要到做位。留下细小颗粒会堵塞层析柱下的尼龙网眼。)直至水清澈无色。②处理用酸碱轮换浸泡,以便使交换剂带

3、上需要的平衡离子。③平衡经处理后,要用大量的水悬浮交换剂,最后用缓冲液平衡2、柱的选择与装柱装填均匀,松紧一致,没有气泡,没有裂缝。3、上样要求加入样品液的体积一般应小于床体积的1/3。4、洗脱剂原则四条:①阴离子交换剂选用阳离子缓冲液(如氨基乙酸、铵盐、Tris等),阳离子交换剂选用阴离子缓冲液(如乙酸盐、磷酸盐等),以防缓冲离子参与交换过程,降低交换剂的交换容量。②缓冲液pH值的选择要使被分离物质的电荷与平衡离子电荷的正负性相同。③选用的缓冲系统对分离过程无干扰。④要确定一定的离子强度。5、洗脱速度洗脱速率太快和太慢都会降低分辨率。二、凝胶过滤层析1、原理:在礙胶颗粒所拘成的立体

4、的网状緒拘中,蛋白质的分子颗粒越大,受到凝胶颗敉的排阻越大,下行越快,优先洗脱出来;分子颗敉越小受到的排阻地小,阻力越大,洗脱出来的速度越十曼。2、常用凝胶:(1)天然凝胶:琼脂糖凝胶(2)人工合成凝胶:葡聚糖凝胶(其商品名称Sephadex),有G-25,G-75,G-100,G-200等型号的凝胶。其中G后面的教据为傅水值,即毎g十胶吸水毫升再乘以10.不同规格的凝胶性质不同,常用G-25脱盐。3、应用:(1)分离、纯化与鉴定;(2)测定相对分子质录;三亲和层析1、原理:利用生物大分子间专一亲和力的层析技术。2、应用:酶与底物、酶与免争性抑制剂、酶与辅因子、抗原与抗体、激素与其受

5、体。四吸附层析1、原理:利用各种成分被表面具有吸附分子特性的固体的吸附程度及其在分离港剂中的港解度差异进行分离,取决于物质的分子結构。2、分类:(1)物理没附,如:话•性炭;化学吸附,如:氧化铝;(3)交换吸附,如:硅胶。思考题:1.什么叫易析技木?常用的易析技木有哪些?2.指出常用层析技术的应用苑围。3.SephadexG-100凝胶柱居析分离蛋白质原理是什么?4.用ScphadcxG25脱盐时蛋白质和敖哪个先出峰?5.相对分子董为8万和10万的蛋白质能否在SephadexG-75柱中分开?为什么?6.将分子量分别为a(90000)、b(45000)、c(110000)的三种蛋白质

6、混合薄液进行凝胶过滤展析,正常情况下,将它们按被洗脱下来的先后排序。7.离子交换唇析与凝胶过波哪种分辨率高?8.离子交换层析的原理?9.如果样品中只有Ala和His(Alapl=6.0,Hispl=7.6),在pH4条件下,这两种氨基酸那一种与CM(阳离子交换剂)结合的紧密?如果用pH4-7的洗脱液梯度洗脱,那种氨基醜先洗脱出来?10.柱层析时湿装柱的注总事项有哪普?11.说说离子交换层析中洗脱液的选择原则12.如何利用凝胶过波层析测定蛋白质相对分子质黄第三章电泳原理与技术目前常用的电泳系统为区带电泳。任何电泳技木方法,均是以某种载体或支持介质作为样品中蛋白质的泳动跑道,常见凝胶电泳

7、的支持介质有(1)聚两嬌酰胺凝胶(2)琼脂糖凝胶(3)没粉凝胶。一聚两綠酸脓凝胶电泳(一)PAGE技木流程简介1.组架(玻板、胶条、U型玻板、封胶)2.制胶(分离胶港液、浓缩胶港液、播入梳子)3.点样4.电泳5.染色6.脱色7.分析(二)两嬌酰胺凝胶聚合原理与凝胶结构1、聚合原理:聚丙矯酰胺凝胶(PAG)是用丙稀醜胺和交联剂甲又双丙綠在值化剂的作用下聚合而成。通常釆用过硫黢狭或核黄素来引发该过程,以N,N,,N?-四甲基^乙二胺(Tetranmethyle

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