利用crisprcas9技术构建定点突变小鼠品系

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1、贵阳中医学院硕士学位论文中文摘要背景：基因敲除动物模型是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。对于了解人类生殖、胚胎发生和发育、遗传疾病的发病机制、药物的筛选发挥重要作用。小鼠不但在生理上与人类相似，而且现已经积累了非常多的遗传资源，是研究人类疾病理想的动物模型。由于传统基因打靶技术的复杂性，且存在费时，困难，工作量大，效率低的问题，难以满足日益增长的科研需求。随着最近对细菌和古细菌抵抗噬菌体感染等外来遗传物质侵袭机制的揭示，基于改造自细菌获得性免疫机制的CRISPR／Cas系统作为一种富有潜力的基因

2、编辑工具获得了科研人员的青睐。目的：为得到特定位点突变的小鼠疾病模型。方法与材料：文章针对Kdm2b蛋白酶活关键位点对应的DNA序列设计sgRNA靶点并与Cas9mRNA共注射小鼠受精卵。将针对Fm03基因的sgRNA、Cas9mRNA及对应的点突变单链寡核苷酸(ssODN)修复模板共注射Nd,鼠受精卵雄原核。得到FO代小鼠，并采用T7Endonuclease工酶切实验及基因测序检测其碱基的突变。结果：经基因修饰的小鼠中同时得到了Kdm2b基因发生移码突变的基因失活型以及关键酶活位点缺失的酶活突变型首建小鼠。同样成功得到了F

3、m03基因发生移码突变的基因敲除和单碱基定点突变的首建小鼠，且基因都发生了高效的生殖系转移，成功建系。结论：通过本研究表明采用CRISPR／Cas9万方数据贵阳中医学院硕士学位论文系统利用同源重组修复依赖与非依赖的两种方式可快速高效的构建特定位点突变的小鼠品系，关键词：基因敲除CRISPR小鼠万方数据贵阳中医学院硕士学位论文ABST队CTBackground：Targeted-knockoutanimalmodelsisanimportanttoolinthestudyofgenefunctioninlivinganimal

4、sandtheresearchofappropriatetargetfordrugs．AlsotheTargeted-knockoutanimalmodelsplayanimportantroleinunderstandingthehanumanreproduction，thegerminationanddevelopmentofhumanembryonic，themechanismofgeneticdiseases，aswellasthedevelopmentofnewdrugs．Rat’Sphysiologyissimi

5、larwithhuman，andit’SheredityresourcehasbeenaccumulatedalotofthattariStheideaanimalmodelfortheresearchofhumandisease．BecauseoftheintrinsiccomplexityofEScell-basedgenetargeting，generatingofknockoutgeneisstillaskill-demanding，time-consumingandcost-intensiveprocess，whi

6、chcannotproperlysatisfiedtheincreasingdemandingofbiomedicalresearch．Withtherevelationoftheadaptiveimmunesystemthatprotectsbacteriaandarchaeafromtheinvasionofphageandplasmid，artificialCRISPR／Cassystemhaveincreasinglybeenregardedasprospectivetoolsforgenomeeditingandg

7、etthefavoriteofresearcher．Objective：Togetthefeasibilityofgeneratingsite—specificmutationsinmouseembryos．MethodsandMaterial：ThroughdirectinjectionofCas9mRNAandsgRNAtargetingcriticalregioncorrespondingtoKdm2benzymeactivity．Cas9mRNA，sgRNAandthesinglestrandoligonucleot

8、idesdonortemplate(ssODN)withpoint3万方数据贵阳中医学院硕士学位论文mutationagainstFm03genewereco—injectedintothemalepronucleusofmouseone-cellembryos．ThenweusetheT