一种富含多糖的关节软骨组织总rna提取方法初探

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1、一种富含多糖的关节软骨组织总RNA提取方法初探刘玉刚,胡旭,付建军,张莹,廖通权,周跃,初同伟(第三军医大学新桥医院骨科,重庆4000387)摘要:目的探索一种适合富含蛋白多糖的关节软骨组织总RNA提取方法。方法:用一步法、trizolTrizol法、plantRNAout法和一步法结合plantRNAout法四4种方法提取了兔子膝关节软骨组织的总RNA,对各种方法进行比较分析,并以获得总RNA为模板,用长距离PCR(LD-PCR)的方法合成了双链cDNA并进行了扩增。结果:一步法、trizolTrizol法、pl

2、antRNAout法获得的总RNA均含有蛋白多糖污染或DNA污染,不能满足实验需要,用一步法结合plantRNAout法提取的总RNA纯度高、完整性和稳定性好,成功逆转录合成双链cDNA。结论:一步法结合plantRNAout法适合关节软骨组织小量高质量的总RNA的提取。关键词:关节软骨;RNA提取;LD-PCR中图分类号:R-331;R34.文献标识码:B基金项目:国家自然科学基金(30672120);重庆市自然科学基金(CSTC2006BB5355)SupportedbytheNationalNaturalSc

3、ienceFoundationofChina(30672120)andtheNaturalScienceFoundationofChongqing(CSTC2006BB5355)作者简介:刘玉刚请补充籍贯:……省……市或县人,男,博士研究生,主治医师,主要从事脊柱关节损伤的修复方面的研究。电话:13228683642,E-mail:bear219@126.com通信作者:初同伟,电话:(023)68774080,E-mail:Chtw@sina.com收稿日期:2009-08-20;修回日期:2009-10-20提

4、取高质量的总RNA合成cDNA是进行基因表达研究的基础。关节软骨组织细胞含量少,细胞的比例约占10%,软骨基质含有大量的蛋白多糖,而多糖的许多理化性质与RNA很相似,在沉淀RNA时,产生富含多糖的凝胶状沉淀,这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水,或溶解后产生粘稠状的溶液,在去除多糖的同时RNA也容易被带走,造成RNA得率的减少,因此从关节软骨中提取高质量的RNA有相当的难度[1]。现有的用于提取动物组织细胞总RNA的方法,如一步法、trizol法等,都是基于酸酚/胍原理基础上的,因其对多糖和RNA分离效果差,不适合提取

5、含蛋白多糖丰富的软骨组织,目前尚未见有成功提取关节软骨组织总RNA的报道。为后续研究关节软骨损伤后的差异表达基因的需要,本实验在参照现有总RNA提取方法的基础上,经过摸索,成功提取出了高质量关节软骨组织总RNA,以此继续进行LD-PCR合成了双链cDNA,解决了关节软骨组织总RNA提取的难题,为后续关节软骨基因表达的研究提供了条件。1材料和方法1.1材料1.1.1组织来源实验用材料为新西兰白兔请补充实验动物来源、体重膝关节软骨损伤后修复组织。于2006年11月购买幼年(4周龄)新西兰白兔,通过开放手术用电钻在双侧膝

6、关节股骨关节面造成直径3mm、深3mm的损伤模型,损伤后4周处死动物,取损伤部位修复组织及周围2mm范围软骨组织及软骨下骨组织,立即放入液氮中冷冻保存。1.1.2主要试济和仪器变性液(6mol/L异硫氰酸胍,37.5mmol/L柠檬酸三钠,0.75%十二烷基肌氨酸钠),b-巯基乙醇,氯仿∶异戊醇(49∶1)混合液,2mol/L醋酸钠50ml(pH4.0),酸性水饱和酚(pH4.5,上海生物工程公司),DNAMarkerDL1000(大连宝生物公司),Trizol(大连宝生物公司),plantRNAout(绵羊天择基

7、因公司),SMART™PCRcDNASynthesisKit(Clontech,USA)。AJ-30I型低温超速离心机(Beckman,USA),Chemilmager5500型凝胶成像仪(AlphaInnotech,USA),PTC-200型梯度PCR仪(Bio-Rad,USA),DU-800型核酸/蛋白检测仪(Beckman,USA)。1.2实验方法1.2.1软骨组织总RNA提取1.2.1.1一步法组织秤量后,按每50mg加变性液1ml,7mlb-巯基乙醇,玻璃匀浆器于冰水浴中匀浆,直至无明显组织块为止。室温静

8、止5min,将匀浆液分装入无RNase1.5ml离心管,每管0.5ml,每管加500ml酸性水饱和酚、每管加50ml2mol/L醋酸钠,、100ml氯仿∶异戊醇混合液,用力摇匀,置于冰水浴上15min,于4℃,12000×g,离心10min。取上清加入无RNase1.5ml离心管,每管加500ml氯仿∶异戊醇(49∶1)混合液,用力摇匀,于4℃,12000×

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