肿瘤坏死因子受体ⅱ-脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文肿瘤坏死因子受体II．脂联素球状结构域融合蛋白生物活性研究BioactiveAnalysisofTumorNecrosisFactorReceptorII—AdiponectinGlobularDomainFusedProtein课题来源：国家“重大新药创制”科技重大专项项目(N0：2009ZX09103—649)专业名称免疫学学位申请人罗满生指导教师高基民教授答辩委员会主席惠宏襄答辩委员会成员孟民杰周荣李红卫马骊论文评阅人王一飞李明黎诚耀2012年5月15日广州博士学位论文肿瘤坏死因子受体II一脂联素球状结构域融合蛋白生物活

2、性研究博士研究生：罗满生指导教师：高基民摘要肿瘤坏死因子(TNF)首先于1975年由LloydOld等发现，因最初发现内毒素能诱导机体一种糖蛋白的表达并引起实体性肿瘤的出血坏死而得名。TNF分游离型和跨模型，都有生物学活性。跨模型TNF(tmTNF，26kD)经TNF转化酶裂解后成为游离型TNF分子(sTNF，17kD)。TNF是机体炎症反应的有力诱导因子，能调节固有性免疫并且在介导机体通过Thl类免疫应答抵抗胞内细菌及某些病毒感染过程中发挥重要作用。然而，TNF表达调节失控也会导致多种病理作用，包括免疫介导的炎症性疾病(IMIDs)!ZHD．氨基半乳糖(Ga

3、IN)／J]旨多糖(LPS)诱导的急性肝损伤、LPS诱导的内毒素休克以及类风湿性关节炎(RA)。因此，TNF成为这些疾病的重要治疗靶点。TNF受体(TNFR)分TNFPd(p55)、TNFRII(p75)两种。由于天然状况下TNF以同源三聚体的形式结合至体内游离的或跨模型受体TNFRI、TNFRII而引发胞内下游一系列信号转导途径的活化引起相应的细胞生物学或病理生理过程，因此，模拟TNF同源三聚体形式的复合分子将能更有利于TNFR与TNF结合而拮抗模型受体与TNF的结合。目前在临床上使用的TNF拮抗剂主要是二价分子，包括可溶性肿瘤坏死因子受体II(sTNFRI

4、I)与IgG的Fc段形成的融合蛋白(sTNFRII．Fc)幂llTNF单克隆抗体(如嵌合型Infliximab、人源化Adalimumab)两大类。因市场庞大，新型高效TNF拮抗剂的研发是研究的热点。摘要脂联素是脂肪细胞分泌的细胞因子，促进骨骼肌细胞和肝细胞对葡萄糖摄取和脂肪酸的氧化，降低血甘油三酯，并提高机体对胰岛素的敏感性。借助脂联素球部(gAD)可自行形成紧密同源三聚体的特性，我们研制出了三聚化的sTNFRII，即可溶性肿瘤坏死因子受体II．脂联素球部(sTNFRII．gAD)融合蛋白。该蛋白能以更接近于天然TNF三聚体的形式结合TNF并拮抗其生物活性。

5、研究认为，由于LPS的暴露而使TNF过度表达能导致肝脏受损。这一观点已经在用特异性抗体或抗血清中和循环TNF而减轻LPS诱导的急性肝损伤作用的实验中得到验证。现己研究表明，促炎症细胞因子级联反应的活化(包括TNF)被认为是临床上严重肝损伤结果这一病理过程中起重要作用的环节。因此，通过拮抗体内过度表达的TNF可以对因一些细菌特别是革兰氏阴性菌感染而引起的内毒素血症(休克)起治疗作用。另一方面，尽管RA的详细发病机制不甚了解但目前以人为其为一种系统性、进展性的伴随免疫炎症的自身免疫功能紊乱，其病理特点表现为主要引起关节滑膜损伤并导致软骨破坏直至骨关节的破坏。传统的

6、疾病缓解抗风湿药物(DMARDs)虽然能有效地改善RA患者的临床症状及提高活动能力，但并未能阻止患者关节进行性损害。有研究发现一方面在RA患者的炎症性滑膜特别在关节软骨．关节翳连接处TNF表达明显增高；并且将人TNF基因敲入小鼠基因组后引起TNF过度表达并导致小鼠产生慢性多关节炎症，发病率达100％。所以，拮抗TNF已成为临床治疗RA的新方向。本研究利用真核细胞表达系统制备该融合蛋白，并通过内毒素诱导的急性肝损伤小鼠模型和类风湿性关节炎大鼠模型、研究其拮抗TNF的疗效，为最终能在临床应用奠定基础。方法1．sTNFRII．gAD体外生物活性研究1．1两种TNF拮

7、抗剂体外生物活性比较博士学位论文①取对数生长期的L929细胞，0．25％胰蛋白酶消化后用1640完全培养液调整细胞合适密度；②取96孔培养板，每孔加入100uL细胞悬液，置37℃，5％C02温箱孵育20h；③稀释样品sTNFRII．gAD、sTNFRII．rc(稀释液中含标准品TNF及放线菌素D)，弃上清；④加入1001．tl稀释样品，培养18～20h；⑤每孔加入159lMTT，37。C孵育4h；⑥去上清，加入DMSO，在酶联免疫检测仪OD570nlYl处测量各孔的吸光值。1．2体外受体．配体复合物测定实验①小鼠重组TNF抗体包被96孔板；②4％BSA封闭，4

8、。C过夜；③TBST洗涤后加入稀释好的