微生物控制技术

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1、“微生物鉴别与控制技术“项目建议书一、立项意义无菌是药品注射剂的重要质量控制指标，注射剂一旦受到微生物的污染，将对患者造成感染，甚至威胁到牛命安全。药典要求对无菌检查不合格的药品不得再进行复验，即实行“一次性报告”制度。当出现阳性结果时，必须仔细对实验过程进行回顾，只有认为其中某个环节出现差错时，才能判定本次实验无效。我公司的产品以注射剂为主，属于高风险生产领域，对生产企业来说，一次性有效的检出无菌不合格将导致整批产品报废。因此，对微生物污染的调查显得尤为重要，应采取适当的手段来对造成污染的微生物(包扌舌洁净环境中)进行有效的鉴别和控制，明确样品被何种微生物污染，明确其来源，根据污染微

2、生物的鉴别结果寻找有针对性的消毒、灭菌方法或工艺流程调整来降低产品受污染的风险。在医药行业领域，微生物鉴别与控制技术可选择的有：(1)生理生化试验;(2)分子生物学试验；(3)根据核酸、蛋白质等成分不同利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)技术。二、项目目标：1、掌握受污染样品的微生物的信息和规律，样品中污染的是什么菌？2、污染微牛物是否是QC实验室造成？为实验室的偏差调查提供依据。3、污染微生物来源于生产中的哪个环节？建立车间的环境菌库4、指导灭菌、消毒和关键生产操作的改进，消除污染隐患。三、检测方法方法A：16srRNA测序，分子生物学手段进行菌种鉴别16srRNA基因是细菌染色体上编

3、码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16srRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16s『RNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便地分类鉴定和检测。该技术主要有三个步骤：首先是基因组DNA的获得，其次是16srRNA基因片段的获得，最后是进行16srRNA基因序列的分析。方法B：梅里埃公司API试验条，其原理是通过生化反应进行菌种鉴别1970年，API彻底的改革了细菌学领域。API系统将当时的鉴

4、定技术引入标准化和微型化。当时的鉴定技术实施复杂，并且解读困难。API技术使细菌鉴定变得简单、快速和可靠。API20E是被开发的第一个鉴定系统。它将一个生化实验试条和一个数据库相结合。通过和美国、日本、澳大利亚、欧洲等国际参考中心协作，API系统迅速扩展。API概念的革新也包括了对计算方法的发展，如众所周知的“数字组合鉴定”。这种方法依序引导了软件程序的设计，使鉴定更容易和更准确。方法C：简单的菌种分类鉴别，革兰氏染色，氧化酶反应和抗生素敏感性试验。优劣势对比：方法优劣分析方法A方法B方法C准确性准确性高，分子牛物学研究是细菌鉴定最具可行度的方法。较为准确，在属鉴别尚可，种鉴别不够准确

5、。该方法需要进行验证，与分子生物学方法比对结果后才可使用。只能进行粗分，寻找规律，无法对菌种进行准确鉴别。便捷性非常简便，实验人员仅需做好分离纯化工作，提供斜面既可。较为复杂，操作者的主观因素很大，必须2人以上共同进行实验，以确保检验不发生明显偏差，较为简便，染色和镜检均为最基本的微生物实验，抗生素敏感性实验结果较为直观。成木400元/菌落100-200元/菌落成木极低四、方法验证：建立快速、准确、成本可接受的方法是微生物控制技术实施的前提条件。通过方法验证形成验证报告后确定微生物鉴别和控制的方法，建立管理流程、操作法的SOP、原始记录，并设计微生物信息库模型，采购必要的分析软件。1、

6、标准菌验证：取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孑包杆菌（根据需要可以增加其他标准菌）的斜面采用方法B（API试剂条）和方法A（16srRNA测序方法）分别进行菌种鉴别，记录结果，标准菌鉴别结果应全部符合，否则方法将无法用于污染菌的鉴定。如条件不允许，16srRNA测序的验证可减免。2、环境污染菌验证取沉降菌培养皿，挑取单菌落，用生理盐水制成菌悬液，均匀涂布在3支营养琼脂斜面，作为备检的菌株，API试剂条和16srRNA测序各用1支，备份1支。首先通过形态观察、革兰氏染色、氧化酶试验等基本鉴别，然后采用上述两种方法分别鉴别。为了准确鉴别菌种，必要时要按照《伯杰氏细菌手册》等补充生化试验

7、。重点要确认API试剂条是否能准确做出菌种鉴别，必要时取备份菌株重复API试剂条的检验，考察其重复性。3、样品污染菌验证取长菌的硫乙醇酸盐流体培养基，用平板划线法或者菌液稀释法在营养琼脂平板上获得单菌落。一下方法与“环境污染菌验证”同。五、实施计划：从准确性和有效性考虑，初期建库阶段应在基木筛选后做30-50个样木的分子生物学鉴定，以确保初期掌握的微生物信息无误，避免项目整体岀现偏差。操作人员验证并掌握API鉴别技术后可在之后大批量菌种鉴别中取