细胞生物学实验（吉林大学）使用流式细胞术检测化疗药物诱导的癌细胞凋亡

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1、课程名称：开放性创新实验实验题目：使用流式细胞术检测化疗药物诱导的癌细胞凋广实验目的：1,掌握细胞传代技术2,了解流式细胞术在生命科学中的应用3,掌握流式细胞仪的基本工作原理与操作4,掌握Annexin-V/PI双染测定细胞凋亡的原理5,学会使用流式细胞仪用Annexin-V/PI双染法测量细胞凋亡实验原理：细胞培养是将细胞从机体中取出，模拟机体内生理条件，在人工条件下使其生存、生长和繁殖，进行细胞生命过程、细胞癌变等问题的研究。传代培养则是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。流式细胞仪(flowcytometer)的工作原理是将待

2、测细胞吸入到被称为鞘液的流动相中，并在鞘液的约束下形成单列细胞柱。通过光学的方法对其中的细胞进行逐个检测。利用得到的散射光和荧光指标,反应出细胞的体积、内部结构、DNA或特定蛋白质等理化特征。生理条件下磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)主要定位于细胞膜内层，是一种细胞膜活性物质。当细胞发&凋亡时，PS会随着细胞膜的外翻而暴露于细胞外，这是细胞凋亡早期的特征之一。Annexin-V是一种能与PS特意结合的磷脂结合蛋白。使用偶联上FITC荧光基团的Annexin-V可以准确方便的通过流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。碘化丙Bg(Propidi

3、neIodide,PI)是一种无法透过完整细胞膜的核酸染料，但在凋亡或死细胞中，PI能够透过细胞膜而与核酸结合并发出特定荧光。因此将Annexin-V与PI联合使用，就可以检测出样品中活细胞、死细胞以及早晚期凋亡细胞所占的比例。所需仪器：细胞培养瓶等相关耗材、超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、医用冰箱、200目过滤网、流式进样管、EPICSXL流式细胞仪、Muse细胞计数仪所需试剂：RPMI-1640培养基、HEPES、胰酶、胎牛血清、70%酒精、PBS缓冲液(PH7.4)、AnnexinV-FITC/PropidiumIodide凋亡双染试剂盒实

4、验过程：1,在RPMI-1640培养基中缓慢滴加HEPES调节PH值，到培养基颜色变化，再加入10%胎牛血清，配置成完全培养基。2,取处于对数生长期的Hela细胞，移除培养基，加入PBS洗涤。3,加入胰酶室温消化3分钟后加入等量完全培养基中和胰酶，再吹打成单细胞悬液，转移至离心管中，1800rpm,离心5min,去上清。4,使用1ml完全培养基重悬细胞沉淀，转移其中的0.5ml至培养瓶中培养两天。5,取出细胞，显微镜下观察细胞状态并记录。1,移除培养基，加入PBS洗涤。2,重复步骤3。3,使用1mlPBS重悬沉淀后，1800rpm,离心5min。4,去上清，

5、细胞沉淀用50pl凋亡检测试剂盒中的结合缓冲液重悬，然后加入AnnexinV-FITC2pl,室温避光孵育15min再加入试剂盒中的PI4pl,室温避光孵育5min后加入450pl结合缓冲液后，过200冃的滤网于流式进样管中待测。5,流式细胞仪上机。上机内容：1.观察流式细胞仪的操作界面：FSC,前向散射光；SSC,侧向散射光；FL1~2,荧光通路1~2（本次实验中，FL1对应FITC检测通路，FL2对应PI检测通路）；gate,门（包括多边形门和十字门）；volts/gain,光电倍增值；event,收集的事件（本次实验对应Hela细胞）。2•调节FSC-

6、SSC信号：调节FSC与SSC信号后面的volts/gain值，使图中的细胞分布群尽量集中，且尽量靠近预设门的中间，使待测细胞呈现单一的正态分布，去除碎片以及黏连的影响，降低实验干扰。大体上，细胞的FSC和SSC信号值正比于volts/gain值。3•调节荧光补偿：为去除荧光信号的相互干扰，首先检测FITC单染的凋亡阳性细胞。通过调节FL2-FL1%值，使细胞全部出现在FL1-FL2图中十字门的下方，且不要过于靠近X轴。然后检测PI单染的凋亡阳性细胞，通过调节FL1-FL2%值，使细胞全部出现在FL1-FL2图中十字门的左侧，且不要过于靠近Y轴，在随后的测试

7、中，保持这两个数值不变。4•调节FL1-FL2信号：通过调节FL1和FL2信号后面的volts值，使阴性对照的绝大部分细胞出现在十字门的左下角（比例达到95%左右），同时在相同参数下使阳性细胞（药物诱导凋亡超过70%）的大细胞群出现在十字门的右上角，确定实验的检测参数。大体上，细胞的FL1和FL2信号值正比于volts值。5.检测样品。观察样品中的细胞数量，再依据上述原则，通过调节FSC与SSC信号使细胞集中在FSC-SSC图中的多边形门中；通过调节FITC与PI信号使FITC-PI图中的细胞快速移入指定的十字门区域中。