放线菌c3-11的抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究

放线菌c3-11的抗菌活性筛选及发酵液稳定性研究

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1、摘要从重庆四阳山区土样中分离到1株放线菌C3-11,该菌株发酵液对14种病原真菌进行室内生物活性筛选,结果农明,C3-11菌株发酵液对汕菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的菌丝抑制率都在90%以上,对其余供试病原菌均有不同的抑制作用。通过对发酵液稳定性的初步研究,表明该菌株的发酵液对光照、温度及酸性条件作用下都较为稳定。关键词放线菌C3-11;抗菌活性;稳定性从微牛物代谢产物中寻找控制有害生物的生物农药是新农药研究的一个重要方向[1],放线菌是重要的微生物资源,是产生抗生素的主要来源。目前从微生物中发现的大约8000种生物活性物质中,近70%是由放线菌产生的[2・5

2、],世界各国对放线菌的研究与资源开发极为重视,其屮农用抗生素的筛选和应用已成为研究的重点。因此,从放线菌中寻找农用抗活性物质有较为广阔的前景。本研究是从我国不同地域采集的土样中,进行广泛地筛选分离,从重庆四阳山区的土样中分离到1株放线菌C3-11,该菌株对汕菜菌核病菌有强烈的抑制作用,同吋对其他病菌也有一定的抑制作用,在确定其生物活性后,又对其发酵液的稳定性做了进一步的研究,现总结如下。1材料与方法1」材料1丄1供试土样。试验所用土样采自于重庆、河南、云南和贵州等地。1」.2供试病原菌。油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黄瓜灰

3、霉病菌(Botrytiscinerea)>小麦赤霉病菌(Gibberellazeae)、苹果腐烂病菌(Cytosporamandshurica)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporium)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)半夏立枯病原菌(Rhizoctoniasolani)、水稻纹枯病原菌(Thanatephoruscucumeris)>烟灰霉病菌(Botrytiscinerea)>玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)>玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)交链抱病菌(Al-ternariaa

4、lternata)>萬苣黑斑病菌(Stemphyliumchisha)>甘薯黒疤病菌(Ceratocystisfimbriata)>大肠杆菌(Escherichiacoli)>枯草芽孑包杆菌(Bacillussubtills)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。1.1.3培养基。PDA培养基,牛肉膏蛋白腺培养基;高氏1号合成培养基(可溶性淀粉20g,KH2PO40.5g,MgSO4-7H2O0.5g,KNO3lg,NaCl0.5g,FeSO4O.Olg,琼脂20.0g,水1OOOmL,pH值7.6〜7.8);液体发酵培养液(1%小

5、米浸出汁1OOOmL,葡萄糖lO.Og,蛋白腺3・0g,NaCl2.5g,CaCO32.0g,pH值7.2〜7.4o用250mL三角瓶分装,每瓶100mL,121°C灭菌30min。);种子发酵培养基(1%小米浸出汁1OOOmL,葡萄糖lO.Og,淀粉20.0g,酵母膏5.0g,蛋白月东5.0g,牛肉膏3.0g,CaCO32.0g,pH值7.2〜7.4)。1.2方法1.2.1菌种的筛选。将土样自然风干,用研钵磨细,过孔径0.1mm筛,称取研细的土壤5g,加入盛有45mL灭菌水的三角瓶中,充分振荡,制成10・1土壤浓度悬浮液。待土粒沉淀后,吸取1.OmL±清

6、液,移入盛冇9mL灭菌水的10mL容量瓶中,制成10・2土壤浓度悬浮液。依此类推,制成10-3>10-4和10・5土壤浓度悬浮液,吸取上述10・3〜10・5土壤浓度悬浮液O.lmL(约2滴),加到高氏1号合成琼脂培养基平板上(加50mg/L酸钾作为抑制剂)进行菌种分离,用灭菌涂布棒涂均。28°C培养,纯化后转接到斜血保存。122发酵液的制备。将保存的菌种划线接种于高氏1号平面培养基上,置于28°C恒温培养箱培养6do将培养好的菌落接入种子发酵培养基屮置于恒温摇床上发酵2d,将种子发酵液以10%的接种量接种于小米液体发酵培养基中,28°C发酵6d后过滤,发酵

7、液4°C冰箱中保存备用。1.2.3抑菌试验。(1)菌丝生长速率法[6]。将原始菌株发酵液10mL与90mL融化的PDA培养基混匀,倒入无菌培养Jill中制成带药培养基平板。培养基凝固后,在每个培养基平板上放入1个供试病原真菌菌饼(直径为4mm),使菌饼带菌丝的一而贴在培养基表面,毎处理重复3次。置于28°C恒温箱中培养72〜96h后,用“十”字交叉法测量供试病原真菌菌落生长直径,用下式计算抑制率。(2)管碟法[6]。将供试菌与适量培养基充分混匀,倒入9cm培养皿中制成带菌平板,每个平板上放上3个牛津杯(内径0.6cm、外径0.8cm、高lcm的不锈钢杯),

8、毎管加入发酵原液0.2mL,以蒸馆水为对照,置于28°C恒温培养箱

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