木聚糖酶的基因资源发掘、分子改造及嗜碱机制研究

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1、④密级：——中国科学院大学Universit、rofChineseAcadem_l,ofSciences博士学位论文木聚糖酶的基因资源发掘、分子改造及嗜碱机制研究作者姓名；拍塞至指导教师：里延塑班盎虽主国型堂瞳煎生毖班基匮学位类别：理堂监主学科专业：熊生物堂研究所：煎生物班五匮2013年5月Genecloning，molecularengineeringandstructuralinsightsintoalkalophilicityofxylanaseByBaiWenqinADissertationSubmittedtoTheUniversityo

2、fChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofPhilosophyInstituteofMicrobiolgoyChineseAcademyofSciencesMay,2013Ⅷ8㈣5删7iiii¨i■■__Ⅲ8洲3Ⅲ2洲YIV学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文不包含任何其他个人或集体已经发表或未发表的成果、数据或撰写过的科研成果

3、，也不包含为获得任何教育机构的学位或证书已使用过的材料。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均己在文中以明确方式标明。申请学位的论文与资料若有不实之处，本人愿承担一切责任。学位论文作者签名：习砌c乏碜●伽易年3-月磁日学位论文使用授权声明本人完全了解中国科学院大学及微生物研究所关于提交、保存和使用学位论文的规定。

4、J意研究所保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸制版和电子版，允许论文被查阅和借阅；论文保存单位及借阅人有义务保护论文作者及单位的知识产权。本论文的成果归中国科学院微生物研究所所有：本人离所后发表、使用本学位论文或与本论文直

5、接相关的学术成果时，第一署名单位仍然为中国科学院微生物研究所。(保密论文在解密后遵守此规定)作者签名：爿冶良碜日期：加侈年丁月冲日导师签名：—二乏。一日期：叩V卜年r月弓口日摘要本文从内蒙碱湖和温泉样品中克隆了5个全长木聚糖酶基因，对来源于嗜碱Bacillussp．SN5的两个木聚糖酶基因XynlOA和XynllA进行了异源表达、纯化及性质分析。对XynIlAG催化结构域XynllA．LC进行了结构解析和分子改造。系统研究了ll家族木聚糖酶的嗜碱机制。论文取得的主要结果有：1．从内蒙古碱湖和温泉中分离筛选了54株产木聚糖酶的菌株，通过测定粗酶液的性

6、质，选定4株菌Anoxybacillussp．R3、BacillusagaradhaerensDLTSl、Bacillussp．SN5和Bacillussp．CN4作为目标菌株，从中克隆了5个全长木聚糖酶基因。2．对两个来源于Bacillussp．SN5的木聚糖酶基因XynlOA和XynllA进行了表征。XynlOA编码348个氨基酸的多肽，分子量约40kDa。序列分析表明Xynl0A属于糖苷水解酶10家族，其氨基酸序列与来源于Paenibacilluslact&154的内切木聚糖酶相似性最高，达68％。XynlOA在E．coliBL21(DE3)

7、中表达，纯化后测定重组酶的性质。结果表明：Xynl0A在最适条件下(40℃，pH7．0)对beechwoodxylan的比活力为104．7U／mg；Xynl0A在25。C时具有80％的酶活，5"C时仍具有29％活性，属于低温酶；Xynl0A在含O．5MNaCl(海水的盐度)的底物中活性最高(134．5％)：Xynl0A在2MNaCl中24h温育后仍具有87．4％的残余酶活。结构分析表明：Xynl0A的表面含有大量的带电荷氨基酸，尤其是负电荷氨基酸，这符合嗜盐蛋白的结构特征。冷活性和耐盐的特性使得Xynl0A在食品工业，尤其是海产品的加工中具有应用潜

8、力。XynllA基因编和2q366个氨基酸的多肽，包括四个部分：N．端27个氨基酸的信号肽、糖苷水解酶11家族的催化结构域、富含Gly伊ro的链接区及家族36的碳水化合物结合区(Carbohydrate-BindingModule，CBM)。完整的木聚糖酶Xynl1A币I]催化结构域XynllA．LC分别异源表达、纯化及性质比较。二者的最适温度均为55℃：XynlIA最适pH为7．5；而XynllA-LC的最适pH为5．5和7．5-8．0，具有较宽的pH活性范围(在pH5．5-8．5保持80％以上的活性)。Xynl1A和Xynl1A—LC均有强的耐

9、碱性，在pH8．5一11．0的缓冲液中37℃温浴lh后残留酶活达80％以上。与XynlIA相比，XynllA．LC术聚糖酶