缝隙连接蛋白43Ser368位点磷酸化参与脑血管痉挛的体外实验研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：荆签字日期．砧年多月％日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大

2、学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(手写)：弓知＼导师签名(手写)：f℃畴。j、签字日期：刎弓年6月寥日签字日期：Ⅺl；年6月9日摘要目的：缝隙连接通道(GJ)介导的细胞间信号通讯(GJIC)是相邻细胞间电化学信号传递的最直

3、接的通路，在血管协同舒缩的调节过程中起重要作用，其中缝隙连接蛋白43(Cx43)在血管壁分布最广泛，并主要通过磷酸化过程实现构象及功能的调节，前期体内实验研究表明在Cx43蛋白及其磷酸化水平与实验性蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛(CVS)的病理过程关系密切，本实验在此基础上，在体外细胞模型中进一步研究缝隙连接蛋白Cx43Ser368位点磷酸化水平的改变在脑血管痉挛病理过程中可能的作用机制。材料与方法：1．原代培养与鉴定SD．大鼠基底动脉平滑肌细胞：无菌条件下迅速分离取出基底动脉，轻柔去除外膜和内膜，采用组织贴块法培养平滑肌细胞，光学相差

4、显微镜观察细胞生长、细胞化学免疫荧光鉴定。2．建立实验性脑血管痉挛细胞模型：原代培养的平滑肌细胞培养基中加入终浓度为10曲MOxyHb孵育24h、48h、72h、96h建立脑血管痉挛不同时段的细胞模型，通过随机双盲的方法，光学显微镜下测定平滑肌细胞的平均长度变化，并应用westemblot检测细胞表型分子n．actin、calponin、OPN的表达变化来反应细胞收缩状态的改变，并检测Cx43总蛋白(T-Cx43)以及其Ser368位点磷酸化(P-Cx43)的比例水平改变，均数士标准差记录结果，采用t检验，进行统计分析。3．Cx43$368位

5、点突变的慢病毒载体构建及鉴定：以pCMV-Cx43cDNA质粒为模板克隆出目的基因Cx43cDNA，并应用PCR技术定点突变Cx43$368位点基因，再构建PLV．Ex3d．p／neo．EFlA《Cx43>IRES／EGFP真核表达载体质粒。测序鉴定后，以阳性目的质粒和辅助质粒共转染293T细胞，包装产生慢病毒，在荧光显微镜下观察转染后的293T细胞，并应用结晶紫染色法检测病毒滴度。4．体外实验研究Cx43Ser368位点突变对脑血管痉挛的影响：病毒载体感染平滑肌细胞效率检测，首先比较不同MOI值对细胞的感染效率的影响，其次观察24h、48h

6、、72h、96h不同时间点的细胞感染效率，最后以最优MOI和最佳摘要时间点感染平滑肌细胞，并检测蛋白水平的感染效率。实验分组为1)病毒组+OxyHb，2)空载病毒组+OxyHb，3)未感染+OxyHb，4)正常对照组(各组分别设置)，观察相应时间点细胞收缩程度的变化，同时通过对收缩标记分子Ct．actin、ealponin进行westemblot检测进一步佐证细胞的收缩状态变化，同前检测T-Cx43表达及其中P．Cx43的变化情况。结果：l。原代培养的基底动脉平滑肌细胞经形态学观察及特异性抗ct-actin抗体免疫荧光鉴定为平滑肌细胞并且纯度

7、达到95％以上。2．成功构建OxyHb诱导的脑血管痉挛细胞模型：细胞长度分别为正常时的69．26士19．231xm、24h为40．57士12．18pan、48h为29．98士20．199m、72h为35．87士19．56pm、96h为42．25+17．94“m，即OxyHb能够诱导平滑肌细胞的收缩，且收缩程度随着孵育时间增加在48h时达到高峰，之后随着时间递增而逐步缓解，Westernblot检测标记分子其中收缩型标记分子a-actin、calponin随着时间变化逐渐升高到48h时达到最大量分别为194．9％硅20．9％(孵育前125．6％

8、硅20．5％)，37．4％士7．8％(孵育前13．8％士9．3％)，72h、96h则均逐渐降低其与细胞收缩程度的相关系数分别为．0．879和．0．945：合成型标记