多聚乙烯基亚胺介导的自杀基因系统对卵巢癌靶向杀伤效应的研究

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1、原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注Nr-31用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：关于学位论文使用授权的声明本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阋；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或韶分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解

2、密后应遵守此规定)论文作者签名：二茎∑辇j师签名雠论文作者签名：二兰：全导师签名f基!孥山东大学博d=学位论文多聚乙烯基亚胺介导的自杀基因系统对卵巢癌靶向杀伤效应的研究中文摘要随着肿瘤基因治疗研究的迅速发展，卵巢癌的基因治疗也成为近年来的研究热点。目前肿瘤基因治疗领域存在的关键技术问题是如何提高基因转导系统的高效性和靶向性。多聚乙烯基亚胺(polyethylenimine，PEI)作为近年来一种新型的非病毒载体，具有较高的转导效率和较低的细胞毒性，为基因转移提供了一条有效的新途径。以肿瘤特异性启动子hTERT和卵巢组织特异性启动子OSP．1调控下的自杀基因系统是卵巢癌基因治疗中的靶向

3、性策略之一。其次在肿瘤的基因研究中，建立动物模型来研究肿瘤的发生、发展．以及各种治疗手段的效果，是临床前脾癯研究的必经之路。而在现有的肿瘤研究中。与临床楣关的动物模型却存在着诸多问题。近年来生物荧光成像系统(bioluminescentimaging，BLI)作为一种新开发的动物模型，具有快速、灵敏、无创和高分辨率的特点，为肿瘤研究提供了良好的技术平台。本课题以多聚乙烯基亚胺为载体，介导靶向性的自杀基因系统转导人卵巢癌细胞，并利用生物荧光成像系统建立动物模型，研究其转导效率和靶向抗瘤效应。全文共分为两部分，现分部叙述如下。第一部分多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑

4、制卵巢癌生长的实验硪究目的：应用多聚乙烯基亚胺将卵巢特异性启动予OSP．1调控下的自杀基因HSV-tk导入人卵巢癌细胞。探讨其体外、体内的抗瘤效应和靶向性。方法：(1)将pGL3一Lue质粒分别介导多聚乙烯基亚胺PEI、脂质体DOTAP和裸DNA转染人卵巢癌细胞SKOV3，检测荧光索酶表达RLU(relativeluciferaseunit)；(2)利用PH将卵巢特异性启动子调控下的真核表达质粒pOSPl-HSVtk山东大学博士学位论文导入人卵巢癌细胞SKOV3、人肺癌细胞NCI—H460和人肝癌细胞Hep02及SMMC7721，MTT法测定GCV对不同肿瘤细胞的毒性；高效液相色谱法

5、(HPLC)检测GCV在SKOV3的细胞内代谢；流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶原位标记(TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡：(3)建立人卵巢癌SKOV3细胞的BALB／C裸鼠皮下移植瘤模型，痛周注射PEVpOSPl一HSVtk复合物，通过HPLC监测体内GCV浓度的变化来评价TK基因在肿瘤组织中的表达效率；(4)同时记录裸鼠的体重、瘤体大小及瘤重，计算体积和重量抑瘤率，并进行肿瘤组织的病理学和TUNEL检测；(5)建立人卵巢癌SKOV3细胞的BALB／C裸鼠腹腔移植瘤模型，腹腔注射PEI／pOSPl．HSVtk复合物+GCV，观察生存时间并计算生存延长率。结果：(I)PEI组的荧光素酶

6、表达活性最高(187．354-6．48)，与另两组相比(45．74±5．98，0．034-0．00)，有显著的统计学差异(P<0．01)；(2)GCV仅对SKOV3细胞呈现明显的的细胞毒性，对NCI—H460、HepG2和SMMC7721细胞没有产生细胞毒性。HPLC检测显示随着作用时间的延长，细胞内GCV水平逐渐下降。流式细胞仪显示转染pOSPl．HSVtk质粒的SKOV3细胞经GCV作用24h、48h、72h后，凋亡率呈明显的增高趋势(8．424-0．76％，18．50±1．78％，34．80+3．46％)；TUNEL检测SKOV3细胞中可见大量凋亡细胞；(3)体内实验中HPLC

7、显示与对照组相比，GCV的浓度在转染pOSPI—HSVtk的肿瘤组织局部显著降低(0．05>P>0．01)：(4)治疗组的肿瘤体积和瘤重显著减小(P