生化21常用分子生物学技术的原理及应用

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1、第二十一章常用分子生物学技术原理及其应用第1节分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)把不同来源而具有一定同源性的DNA分子放在同一溶液中做变性处理，或把单链DNA与RNA放在一起，在一定条件下，它们之间的同源区域可按碱基互补原则复性形成杂合双链(heteroduplex)，这一过程称为杂交。在杂交之前，通常用琼脂糖凝胶分离待测的DNA分子，再将分离的DNA片段转移到特定的支持物上。由于转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置一样，故称为印迹（blotting）。印迹（b

2、lotting）（一）Southern印迹杂交Southern印迹杂交（Southernblotting）是指DNA与DNA分子之间的杂交。其基本过程是将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性后，将凝胶中的DNA分子转移到一定的固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。M1210×SSC转移缓冲液Whatman滤纸凝胶Whatman滤纸纸巾玻璃板重物支持物500g12与探针同源杂交的基因DNA片段基因组DNADNA酶切片段内切酶NC或尼龙膜NC膜或尼龙膜基因组DNA的定性与定量分析。如对在基因组中特异基因的定位及检测等。重组质粒和噬菌体的分析。Sou

3、thertblotting用途（二）Northern印迹杂交利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northernblotting）。Northern印迹杂交基本原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。Northern印迹杂交的基本过程相同点：名称相对于Southernblotting转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法不同点原理均为毛细作用Northernblotting用途检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平。

4、比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。二、蛋白质印迹技术(Westernblotting)蛋白质印迹技术是根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子对其进行检测。最常用的蛋白质是抗体，因此被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质的位置可保持在胶中的原位上。与DNA和RNA印迹相似之处蛋白质的转移只有靠电转移蛋白质的检测以抗体作探针用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗

5、体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。与DNA和RNA印迹不同之处Westernblotting应用检测样品中的特异蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的定量分析蛋白质分子的相互作用研究三种印迹技术的比较Westernblotting垂直槽Northernblotting水平槽Southernblotting水平槽第2节PCR技术的原理与应用（PolymeraseChainReaction，PCR）聚合酶链反应PCR技术是1985年由美国科学家KaryBMullis建立的体外

6、扩增基因片段的方法，它具有特异、敏感、产率高、简便、重复性好、易自动化等突出优点，是分子生物学技术中一项具有革命性的创举。PCR方法被美国Science杂志评为1989年的十大科技成就之一，而TaqDNA聚合酶被评选为象征1989年的“年分子”(themoleculeofyear)。5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、PCR技术的基本原理Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以

7、扩大100万倍以上。模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+PCR体系基本组成成分二、PCR技术的主要特点1.特异性强2.灵敏度高3.简便快速4.对标本的纯度要求低2.采用PCR方法获得目的基因引物选择：特异引物、随机引物、简并引物1.采用RT-PCR方法扩增目的基因三、PCR技术的主要用途（一）目的基因的扩增与克隆（二）基因的体外定点突变（三）基因突变分析（四）DNA和RNA的微量分析（五）DNA序列测定三、PCR技术的主要用途(Sanger双脱氧链终止法)HOPOPOPOCH2OOOOHOHOHOA,C,GorT1′3′OHαβγ5′双脱

8、氧核苷三磷酸脱去DNA链末端合成终止法Sanger1958年和19