硒蛋白S基因表达与过氧化氢介导的ECV304细胞损伤关系的研究

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1、硒蛋白S基因表达与过氧化氢介导的ECV304细胞损伤关系的研究硕士研究生：指导教师：指导小组：专业名称：刘颖杜建玲教授邢倩副教授内科学摘要目的：体外构建含shRNA的硒蛋白S(SelenoproteinS，SelS)基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，将其瞬时转染至人脐静脉内皮细胞株(ECV304)中，将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及SelS低表达组，以不同浓度的过氧化氢(H202)损伤后，观察各组细胞损伤前后的氧化应激指标及窖蛋白．1(Caveolin．1，Cav．1)、蛋白激酶C0‘(PKCct)表达水平的差异，探讨S

2、elS的作用是否通过PKC通路发挥作用，及此通路与Cav．1的关系，为研究内皮保护策略提供新的实验依据。方法：1．构建三条含shRNA的SelS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，应用脂质体转染技术将质粒瞬时转染至ECV304细胞中，以GAPDH为内参照半定量检测SelSmRNA水平的表达，筛选有效干扰质粒。2．将ECV304细胞分为未转染组、SelS高表达组、空载体转染组及SelS低表达组，以GAPDH为内参照，实时定量PCR方法检测SeISmRNA水平的表达；以IB-aetin为内参照，Westernblot方法检测SelS蛋白水平的表达。3．各组细

3、胞分别经含有终浓度为0、400、600、800及1000Ltmol／L的H202的培养液作用6h后，四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察H202对细胞增殖能力的影响；取不同浓度损伤的各组细胞上清液，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量，黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力。4．根据MTT结果，以H202浓度为8001．tmol／L的培养液作用各组细胞24h后，提取各组细胞总RNA及总蛋白，采用实时定量PCR方法检测各组细胞Cav一1及PKCamRNA水平的表达；Westernblot方法检测Cav-1及PKCa蛋白水平的表达。结果：1．成功构建S

4、elS基因干扰质粒及SelS基因高表达质粒，而且设计的三条干扰质粒均可干扰内皮细胞中SelS基因的表达。实时定量PCR及Westernblot证实SelS低表达组的SelSmRNA及蛋白表达水平均较未转染组、SelS高表达组及空载体转染组明显减低，未转染组与空载体转染组表达无差异(P>0．05)。2．细胞生存率(％)；ECV304细胞暴露于含不同浓度的H202的培养液中6h后，细胞生存率明显下降；各浓度组的细胞生存率在SelS低表达组(84+2．0、69+1．0、60士1．5、42士1．5、234-2．0)均较未转染组、SelS高表达组及空载体转染组低(P

5、<0．01)；在H202浓度为800、1000卜tmol／L时，SelS高表达组(714-1．5，634-2．6)的细胞生存率明显高于未转染组(644-0．5，454-2．6，P<0．01)及空载体转染组(634-1．5，42士3．5，P<0．01)；空载体转染组与未转染组相比差异不显著(P>0．05)。3．MDA含量(nmol／m1)：各组细胞上清液中MDA的含量随着H202浓度的升高而增加；在H202浓度为600txmol／L时，SelS低表达组(6．52+0．16)的MDA水平高于SelS高表达组(3．69士0．16，P<0．05)；在H202浓度为

6、800、1000I．tmol／L时，SelS低表达组(15．434-0．99，27．004-0．70)的MDA水平则高于未转染组(10．10+0．40，17．974-0．48，P<0．05)及空载体转染组(9．504-0．46，16．604-0．80，P<0．05)；SelS高表达组的MDA水平在这三个浓度(3．69+0．16，6．24士0．51，l0。414-0．35)均低于未转染组及空载体转染组(P<0．05)；H202浓度为l0009mol／L时差异更为显著(P<0．01)：空载体转染组与未转染组相比差异不显著(P>0．05)。4．SOD活力(U／m

7、1)：各组细胞上清液中SOD的活力随着H202浓度的升高而减弱；在H202浓度为600、800、l000pmol／L时，SelS低表达组(6．624-0．53，5．094-1．65，3．48+0．88)的SOD活力则明显低于未转染组(7．524-0．29，5．704-0．22，4．624-2．33)及空载体转染组(7．124-1．63，6．10士1．78，5．004-1．27)(P<0．05，P<0．01，P<0．01)，在H202浓度800、l000I．tmol／L时减低更为明显(P<0．01，P<0．01)；SelS高表达组的SOD活力(8．34+0．

8、16、7．484-0．87、6．60+1．58)明显高于未转染组及