亲和素在脂单层膜上的二维晶体研究

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1、维普资讯http://www.cqvip.com讲谔屯掘第40卷第2期CHINESESCIENCEBULLETIN1995年1月／，卜【0。。一亲和素在脂单层膜上的二维晶体研究，1覃宏隋森芳／(清华大学生物科学与技术系．生物膜与膜生物工程国家重点实验室。北京10O084)关键词!!堕苎三纠电子晶体学月j，／月⋯l一／＼’生物大分子的二维晶体可以利用电子晶体学的方法进行结构分析]．利用脂单层膜对蛋白进行二维结晶是一种比较新颖的方法．这一方法最早是由美国斯坦福大学Kornberg教授领导的实验室开创的目．亲和素是一种从

2、鸡蛋清中提取的糖蛋白．它和链霉亲和素在生物活性上有着惊人的相似性．两者都由4个等同亚基组成．每个亚基上有1个与生物素分子结台的活性部位．两者与生物素的结台都非常牢固，可以认为是一个不可逆的过程．亲和素是一种碱性蛋白，每个亚基上有1个N连接的寡糖链，而且寡糖链的成分很不均一m．而链霉亲和素是一个无糖基的中性蛋白．这些不同使得亲和素的结晶要比链霉亲和素困难得多．生物素是一种小分子化台物．当它和亲和素蛋白结合的时候，只有头部的环脲基团直接与亲和素蛋白分子发生作用．因此，人们可以通过化学方法将生物素分子的尾部和磷脂的头部耦

3、连起来．这样形成的生物素化磷脂保持了与亲和素蛋白特异结合的特性．我们实验室经过多年的努力得到了亲和素蛋白在生物素化的磷脂单层膜表面的二维晶体，并通过对负染样品的电镜图片的处理，对亲和素分子的结构傲了初步的分析．1材料和方法生物素、生物素一N一羟基琥玻酸酯、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dlmyristoylphosphatidylethanolamine，DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dipalmitoylphosphatidylethanolamine，DPPE)、二豆蔻酰磷脂酸(dimyristoylphospha

4、tidy]acid，DMPA)都从Sigma公司购得．二油酰磷脂酰胆碱(dioeloylphosphatidylcholine，DOPC)从AvantiPolarLipids公司购得．亲和素按Green的方法从鸡蛋清中提取．两种生物素化的磷脂(N—Biotinyl—dipalmitoyl—L一一phosphatidylethanolamine．B-DPPE；N—biotinyl-dimyristoylphosphatidy]ethanoamine．B-DMPE)按Baryer的方法台成．亲和素蛋白在生物素化的脂单层

5、膜表面上二维有序化的原理见图1．首先在空气与水的界面上展开一层脂单层膜．脂膜中含有生物素化的磷脂．这样溶液中的亲和素蛋白分子可以通过与生物素分子的结合而被抛锚在膜表面上．在维持一定的膜压力的情况下，结合在膜表面的亲和素蛋白分子可以通过侧向的相互作用聚集形成规则排列的二维晶体．1994—04—22收稿。1994-o8—13收修改稿·国家八六三’计崩资助项目·’联系人维普资讯http://www.cqvip.com第2期科学通报磷脂单分子层蔽实验中，为了节省样品用量，二维晶体是用液滴法获得的．先将蛋白溶液滴在聚四氟乙烯

6、的小孔中，然后在溶液表面滴加适量的磷脂溶液．待有机溶剂挥发以后，在蛋白溶液表面就会形成一层脂单分子层膜．蛋白质分子可以通过与磷脂头部的生物素基团的特异结合聚集在单层膜表面．在适当的条件下，结合的蛋白分子便能够自组装成二维晶体．本实验中将17．5L的蛋白溶液滴加在直径4mm，深O．5mm的聚四氟乙烯小孔中，然后在其上面滴加1的磷脂溶液．磷脂样品为B—DPPEfDOPC(1：4，mol,tmo1)，总浓度控制在0．7mg／mL左右，溶剂为氯仿／甲醇(3：1，WV)．蛋白溶液中含200~g／mL的亲和素、50mmol／L

7、Tris—HC1，l50mmol／LNaC1，pH值为7．0在室温或4℃温育，时间从12h至几个星期不等．温育过程在密封条件下完成，以避免溶液的挥发．温育完毕，将表面带有蛋白晶体的脂单层膜水平转移到覆盖了碳膜的电镜铜网上．然后先将铜网用一滴蒸馏水清洗一下，再用1％的醋酸铀染30～60s．负染后的样品用清华大学分析中心的日立H-800透射电镜观察记录．用光衍射方法来评判电镜照片的好坏．将最好的图象用数字化仪转换成数字图象供计算机分析．计算过程采用了MRC电镜图象处理程序包．Fourier合成过程只选用了质量较好的点．

8、大部分计算工作在vAx11，75O计算机上完成．图象显示和衍射指认工作在IBM兼容486机上完成．2实验结果二维结晶过程尝试了多种不同比例的磷脂样品，包括B—DPPE／DOPC．B—DPPE／DPPE，图2亲和素二维晶体的电镜观察B—DMPE／DMPE，DMPA／DOPC．同时我们也用{疰滴方法结晶．碑脂样品中古B—DPPEn】2mIrIL．尝试DMPE和硬