节杆菌烟碱脱氢酶性质及应用研究

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时间:2019-05-23

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1、摘要烟碱脱氢酶可以广泛应用于烟草行业中。本论文筛选和鉴定了一株能高效降解烟碱的节杆菌(Anthrobactersp),研究了烟碱脱氢酶的产酶条件,进而对烟碱脱氢酶进行了纯化和酶学性质的研究。另外,还对烟碱脱氢酶在烟草薄片中的应用进行了初步研究。论文的主要内容和结论如下:通过平板筛选和摇瓶复筛。从土壤中筛选出一株能高效降解烟碱的菌株,根据16SrRNA序列分析、培养特征及生理生化特征分析,该菌株鉴定为节杆菌(Arthrobactersp)。经摇瓶实验,Arthrobactersp.的较好的发酵产酶条件为:初始pH7.0,通气条件(摇床转速)

2、220r/min,接种量5%,30"C下能进行良好发酵。其最优培养基组成为:(NH4)2S0419/L;酵母粉19/L;Nicotine4ml/L;无机盐:Mgs04.7H2O.02%、MnS04.4H200.004%、CaCl2.2H200.002%、K2HPO一..3H2013.39/L、KH2P0449/L。烟碱脱氢酶粗酶液经硫酸铵沉淀,离子交换柱层析分离和凝胶过滤层析分离纯化,得到了电泳纯的烟碱脱氢酶。分离纯化过程中酶被提纯了44.67倍,酶活得率为6.57%。烟碱脱氢酶的最适反应nH为6.85左右,在pH5.5-8.0范围内都很

3、稳定。烟碱脱氢酶的最适温度为40"(2。各种金属离子中,Mn2+、c02+能提高酶活力,Cu2+、Fe“、ca2+对酶活力有抑制作用。Na+离子对酶活力影响不丈。螫合剂EDTA能提高一定的酶活力,比对照样品提高了l8%。在温度30"C、物水比1:10、pH7.0时用水溶液浸提烟末8小时后,烟末中的烟碱提取率较高。在烟草薄片提取液中接入6%的节杆菌z3的菌液,306C培养48小时后,烟碱含量下降了31.15%。在烟草薄片提取液中加入2%的烟碱脱氢酶酶液,40℃下反应16小时后,烟碱含量卜降了50.58%。在烟草薄片中加入2%的经过烟碱脱氢酶

4、处理的薄片提取液,可明显提高烟草薄片的可用性。关键词:节杆菌烟碱脱氢酶烟碱降解烟草薄片ABSTRACTNicotinedehydrogenasehaveattractedconsiderableresearchinterestinrecentyearsbecauseitspotentialapplicationinthetobaccoindustry.Inthepaper,Nicotinedehydrogenaseproducingstrainswereisolatedfromsoilbyscreeningwithnicotineasth

5、esolecarbonsouFce,andamongthemahighnicotinedegradationstrainwasselectedbyexperimentsinshakeflasks.Bytheexperimentalresultsofthemorphological,physiologicalandstructuralcharacteristicsofbacteriums自rainandbythecomparisonofitswholesequenceof16srRNAwiththatofthetypestrainsofal

6、lknownArthrobacteringenebank,itwasshowedthatthe16srRNAofbacteriumstrainandthatofArthrobacterwas97.8%homogenous.ThemforebacteriumstrainwasnamedasArthrobactersp..TheeffectsofdifferentfactorsonnicotinedehydrogenaseproductionbyArthrobactersp.werestudiedinshakeflaskcondition.T

7、hebetteractivityofnicotinedehydrogenaseisreachedafter48hofculturinginrotaryshacker(220r/min)at30"(2,initialpH7.0,4%inoculumculture.NicotinedehydrogenasewaspurifiedfromtheculturefiltrateofArthrobacterso.byammoniumsulfateprecipitation,ionexchangechromatographyandgelfiltrati

8、on。SDS—PAGEelectrophoresisofthepurifiedfractionmitigatedasimplebandwhichrevealedthisenzymewaspur

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