家蚕雌特异分子标记筛选与Bmdsx基因的表达研究

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1、西南农业大学硕士学位论文家蚕雌特异分子标记筛选与Bmdsx基因的表达研究姓名：王慧超申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：朱勇;夏庆友2003.5.1家蚕雌特异分子标记筛选与·B口dsx基因的表达研究特种经济动物饲养专业硕士研究生王慧超指导教师：朱勇教授夏庆友教授(西南农业大学蚕学与生物技术学院蚕桑学重点实验室)(摘要)家蚕是一种重要的经济昆虫，是研究昆虫性别调控的理想模式生物。在家蚕中很容易获得多倍体和人工雌雄嵌合体。家蚕的性别决定是无脊椎动物中的一个上位体系模式，因此，家蚕的性别调控机制研究将有助于理解无脊椎动物复杂的性别调控

2、机制。家蚕的性别调控机理也相当复杂，目前，其分子生物学研究还处于起步阶段。本研究的一部分内容是：通过RAPD．PCR方法来获得雌特异性分子标记，然后通过克隆、测序及序列分析结果，来初步推测该分子标记是否来自于家蚕的w染色体，或是否与家蚕的性别调控相关。最后，进一步通过PCR验证来确证该片段的雌特异性．／幽f基因是位于果蝇性别决定级联末端，控制其性别分化的主基因。占所出x是与果蝇妇基因同源的家蚕基因，最初是从家蚕的EST数据库中得到的．另外，迄今为止，该基因也是唯一的、得到实验研究证明了的家蚕性别调控基因，现有的研究表明，Bmd8x基因不仅在c

3、DNA序列上-q妇基因同源，而且在功能上也具有相同性，即砌d球基因是调控家蚕性别分化的主基因-而且，已有的实验研究表明，该基困是二个单拷贝基因：p本研究的另一部分内容是：首先根据Bmdsx的eDNA序列来设计一对特异引物，运用TaKaP咀RNALA“PCR(AMV)I．1试剂盒进行该基因在家蚕组织中的mRNA表达分析，从而，为进行该基因在特定组织中的定量表达分析和砌缸基因在家蚕中的RNAi检测实验奠定基础。／1．雌特异性枷分子标记的筛选、克隆、测序、序列分析及其雌特异性的验证以家蚕YOIO、C100的雌雄蚕为材料，分别提取基因组DNA。然后运

4、用随机引物来对Ⅲ同一品种家蚕的雌雄基因组DNA进行筛选，通过大量的引物筛选，从中得到一条355bp的雌特异性分子标记。然后对该标记进行了成功的克隆，并进行了序列浏定，以及运用blastx和blastn软件进行了序列分析。序列分析结果表明，所得雌特异性分子标记的功能目前还不清楚。最后，又根据所测得的序列进行设计引物，通过YOIO、C100和另外的4个品种，共6个家蚕品种进行了对该分子标记的雌特异性验证．从而初步推断该分子标记来自于家蚕的w染色体。当然，是否真正来源于家蚕的w染色体还有待于进一步的实验研究。2．Bmdsx基因在家蚕不同组织中的表达

5、分析运用日本东京大学Shimada等人检测Bmdsx基因时所设计的引物，采用TakaRaRNAL—PCR(AMV)Vorl．I试剂盒说明书进行实验操作，最终分析被检测组织中有无Bmd,Ⅸ基因的mRNA表达。实验结果表明，在家蚕C108(辛，6)5龄6、7天的中肠组织中均得到了预期的实验结果：在雌蚕的中肠组织中得到了475b“约)特异性条带；在雄蚕中肠组织中得到了226bp特异性条带(而且226bp的主带又得到了克隆、浏序及序列分析鉴定的印证)。即，Bmdsx基因在雌蚕组织中是以雌特异性方式进行表达的；在雄蚕组织中是以雄特异性方式进行表达的，这

6、与Shimada等人的实验结果是相吻合的。同时，本部分研究也有一个新的发现，即在田岛嵌合体化蛹后第3天和第lO天的卵巢中，同时得到了雌(约475bp)．雄(226bp)的两条主带。这说明Bmd,口基因mRNA在田岛嵌合体中同时以雌雄两种方式进行表达．结合本实验结果与前人的实验结果可知：①由到目前为止，厨幻在所有已被检测过的家蚕组织中均有表达，可初步推断詹a：”可能在家蚕的大部分或全部组织中有表达，是否确实是这样，还有待于进一步进行研究．②家蚕的性别分化在胚胎早期就形成了，但g∞dsx基因从幼虫期到成虫期均有表达，这说明该基因可能和dsx基因对

7、于果蝇拥有某种性别表型中是必不可少的这一点相类似，即，lhdsx基因可能对于家蚕拥有某种性别表型是必不可少的。]．步，、／、关键词：家蚕；雌特异分子标记筛选；丑驯酞基因表达，IVThefemale．specificmolecularmarkerselectingandBmdsxgeneexpressionstudyingSpecialty：ThebreedingofSpeciallyEconomicalAnimalSupervisors：ProfessorZhuYongProfessorXiaQing—youMasterCandidate：W

8、anghui—chaoAbstractBombyxisOReoftheimportanteconomicinsects．Itisasuitablemodelorga