海参钙离子通道基因的克隆与性质分析

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1、研究生：杨冠科指导教师：丛丽娜教授海参钙离子通道基因的克隆与性质分析海参钙离子通道简介论文的主要工作内容结论与展望②①③海参（SeaCucumber）海参自溶现象，困扰生产商多年养殖过程中遇到的诸多问题，持续出现传统的理论解释和研究方法不能满足生产和科研的需要。关键问题-------海洋的高盐浓度及高压环境盐离子浓度离子通道离子通道（IonChannel）钙离子通道本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道β亚基基因进行了研究用生物信息学手段对所得到的该基因全序列进行了性质分析论文的主要工作内容总RNA的提取利用设计的简并引物进行RT-PCR设计引物，进行3'R

2、ACEPCR设计引物，进行5'RACEPCR拼接全序列并进行生物信息学分析总RNA的提取TRIzol法RT-PCR简并引物的设计为了设计简并引物，我们比对了如下物种钙离子通道β亚基的氨基酸序列：合浦珠母贝(Pinctadafucata,GenBankaccessionnumber:EF154452)紫色球海胆（Strongylocentrotuspurpuratus,GenBankaccessionnumber:XM_785360）锥实螺(Lymnaeastagnalis,GenBankaccessionnumber:AF484087)人(Homosapiens

3、,GenBankaccessionnumber:BC075049)秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,GenBankaccessionnumber:AF000198)牛（BosTaurus,GenBankaccessionnumber:AF174417）曼森血吸虫(Schistosomamansoni,GenBankaccessionnumber:AY277532)目的：扩增海参的钙离子通道β亚基的保守区最终引物HS4-1:5′-ARYAATGAYTGGTGGAT-3′HS4-2:5′-GCYTTYTGCATCATRTCT-3′注：R=A/

4、GY=C/TRT-PCR结果二次PCR结果RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图SjCaβ保守区测序结果443bpSjCaβ保守区的BLASTX长度为443bp的产物5‘RACE实验3‘RACE实验拼接SjCaβ全序列3′RACE引物设计3′RACEOuterPrimer:5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′HS4-1-GSP1(OuterPrimer):5′-TTCACCCTGGCTAACTCACG-3′3′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTAT

5、AGG-3’HS4-1-GSP2(InnerPrimer):5′-GAATCGCTACGGAGAACGAAAAGTG-3′使用试剂盒：3′-FullRACECoreSetVer.2.0（TaKaRa）3'RACEPCR结果3’OuterPCR3’InnerPCR3’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图SjCaβ3'RACE测序结果序列长为1019bp经过序列比对得到此序列的5′端与SjCaβ序列保守区的3′端有188个碱基重合，且有poly(A)尾初步判断3′端的扩增是成功的5′RACE引物设计5′RACEOuterPrimer

6、:5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′HS4-1-GSP3(OuterPrimer):5′-AGGCGGTGTGTTATCAGATTGCT-3′5′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′HS4-1-GSP4(InnerPrimer):5′-GTGTCCCACTTTTCGTTCTCCGTAGC-3′使用试剂盒：5′-FullRACEKit（TaKaRa）5'RACEPCR结果5’InnerPCR5’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图S

7、jCaβ5'RACE测序结果序列长为879bp经过序列比对得到此序列的3′端与SjCaβ序列保守区的5′端有281个碱基重合因此可初步判断5′端是扩增成功的把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβcDNA基因全长1867bp将该cDNA序列提交至GenBank（GenBankaccessionnumber:EU853658）SjCaβ的生物信息学分析利用NCBI的ORFFinder分析，SjCaβ全长cDNA中，5′非编码区（UTR）179bp，3′UTR74bp，开放阅读框（ORF）长度1614bp，编码537个氨基酸在3′端的非编码区中，距离poly(A)

8、尾上游10个核苷酸的位置