木糖产乙醇酵母的筛选及分子生物学改造

《木糖产乙醇酵母的筛选及分子生物学改造》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、江南大学硕士学位论文木糖产乙醇酵母的筛选及分子生物学改造姓名：张凌燕申请学位级别：硕士专业：发酵工程指导教师：石贵阳;王正祥20080601摘要摘要随着能源危机的日益加剧，化石燃料R益减少，国际原油价格不断上涨。以纤维质原料生产燃料乙醇是目前国内外的研究热点之一。其研究关键之一就是选育一株能有效利用各种糖底物，且高效产生乙醇的微生物菌种。本论文以此为研究点，采用代谢工程育种策略，以筛选得到的野生型热带假丝酵母为研究对象，通过改变其代谢流来达到提高乙醇产量的目的。从256个自然样品中筛选得到1株可高效转化D．木糖的酵母441．28．1。根据常规形态鉴别

2、，生理生化实验测定，以及ITS区域核酸序列同源性比较分析，证实该菌株属于Candidatropicalis(热带假丝酵母)，其ITS序列在GenBank的登记号为EUl21523，Candidatropical&(热带假丝酵母)已保存于中国高校工业微生物资源数据平台，保藏编号为CICIMY0092。以筛选出来的热带假丝酵母为研究对象，通过代谢产物分析发现该酵母木糖代谢的主要产物为木糖醇，葡萄糖代谢的主要产物为乙醇。通过分析酵母的代谢途径并测定木糖代谢途径中的两个关键酶的比酶活力后，并结合文献报道，确定了代谢工程育种策略为：通过增加细胞内木糖醇脱氢酶的

3、表达量，来减少木糖醇的积累，试图将代谢流引向乙醇形成方向，以达到提高乙醇产量的目的。以本实验室先期构建的pXY212-XYL2质粒为基础载体，构建了含有潮霉素抗性的质粒pYX212-XYL2．hygro(该质粒用于整合表达时，需先用限制性内切酶NotI先将其线性化)，电击转化进入酵母，潮霉素抗性平板上筛选得到转化子。提取整合表达的重组菌染色体进行PCR验证，得到1．7kb的树干毕赤酵母。m2基因，说明该基因已整合到酵母染色体上。酶活测定后，发现游离表达的重组菌的比酶活力达到O．5u／mg，比原始菌株提高了3倍；而整合表达的重组菌的比酶活力仅提高了15

4、％，提高幅度有限。木糖发酵实验发现，游离表达的重组菌株与原始菌株相比，木糖醇得率降低了3倍，乙醇得率提高了5倍；整合表达的重组菌株与原始菌株相比，乙醇得率没有发生明显的变化，但木糖醇积累量有所降低，这与目的基因表达量有关。发酵实验表明，提高木糖醇脱氢酶的表达量，有助于减少中间代谢产物木糖醇的积累，提高乙醇得率。通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性，这对研究酵母利用纤维质原料生产燃料乙醇具有重要启示。关键词：热带假丝酵母木糖乙醇木糖醇脱氢酶AbstractAsthefossilfuelresourcesdecreasingandtheene

5、rgycrisisstrengtheningintheworld，ethanolfermentationusingfibreresourceshasbecomeahotspotrecently．Thekeypointofthisresearchfieldismicrobialstrainselectioncapableofproducingethanolfromvariouscarbohydratese珩ciently．Inthisthesis．thewildCandidatropicaliswaschosenastheoriginalstrain．

6、MetabolicengineeringbreedingstrategyWasappliedtomodifythemetabolicfluxinordertoincreasetheethanolyield．Oneyeaststrain，whichWasisolatedfrom256naturalsamples，wasfoundtobeabletoutilizeD．xyloseeffectively．OnthebasisofassimilationphysiologicaltestsandMolecularbiologyteast．allofthede

7、tectionledtotheidentificationofyeaststrainasastrainofCandidatropicalis．GenBankaccessionnumberofITSnucleotidesequenceWasEU121523．ThestrainWassubmittedtotheCultureandInformationCentreofIndustrialMicroorganismsofC：hinaUniversitiesandthecorrespondingserialnumberWasCICIMY0092．TheCan

8、didatropicalisobtainedWastakenasthefurtherresearchstra