生物分离工程技术第四张细胞破碎技术

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1、生物分离（工程）技术主讲：吴元喜E-mail:wuyuanxi@mail.hust.edu.cn联系电话：027-877923042010年8月生物工业下游技术一般工艺过程第四讲细胞破碎技术一、概述二、常用的细胞破碎技术及其应用三、细胞破碎技术研究的发展方向四、思考题一、概述（一）细胞破碎的意义（二）细胞壁的成分与结构（三）细胞破碎过程的检测（一）细胞破碎的意义目的：细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型成分的基础。有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性药物成分都是必要的。细胞破碎与上游和下游工艺设计的关系上游通过细胞的生理状态对细胞破碎效果产生影响；而下游则

2、要考虑去除细胞碎片和细胞蛋白质的污染等对产品活性的影响。细胞破碎过程中必须考虑的因素细胞壁的坚韧程度、目标产品的性质、破碎的规模、方法、费用等.（二）细胞壁的成分与结构细菌细胞壁主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多层网状结构。霉菌的细胞壁大多由几丁质和葡聚糖构成，含有少量蛋白质和脂类。酵母和真菌的细胞壁主要为葡聚糖为β-1，6葡聚糖，通过β-1，3糖苷键与D-葡萄糖第一侧链交联，也含有甘露糖和几丁质植物细胞壁：含纤维素、半纤维素、木质素等原核细胞的结构电镜下：（1）革兰阳性菌细胞壁较厚，具有20～80nm的肽聚糖层，约占细胞壁干重的

3、50％。（2）革兰阴性菌的肽聚糖层较薄，仅2—3nm，占细胞壁干重的10％左右。（3）在肽聚糖层外还有一较厚的外壁层，约8～10nm，主要为脂蛋白、脂多糖和其他脂类，含量为细胞壁干重的80％。酵母细胞的结构植物细胞的结构（三）细胞破碎过程的检测①革兰氏染色法②次甲基蓝染色法③测定核酸与蛋白质含量④离心细胞破碎液观察①革兰氏染色法用革兰氏染色剂进行染色破壁的酵母呈粉红色，而未破壁的酵母呈兰紫色，分别计数，并采用相同的稀释度用血球记数板进行镜检记数，计算破壁率。α---破壁率（100%）C---破壁前的细胞数（相同稀释倍数）C’---破壁后的细胞数（相同稀释倍数）n1-

4、--染色后呈紫色细胞数n2---染色后呈粉红色细胞数②次甲基蓝染色法取未经灭活的发酵液0.5ｍＬ,用9ｇ/Ｌ的生理盐水稀释100倍后,用次甲基蓝染色5ｍｉｎ,用血球计数板计数,计算出细胞的存活率。酵母存活率：=[1-(染色细胞总数/酵母细胞总数)]×100%.③测定核酸与蛋白质含量分别在260和280ｎｍ波长下,测定发酵液的光吸收值，用Lorry法测量细胞破碎后上清中的蛋白质含量也可以评估细胞的破碎程度，判断细胞破碎率。核酸提高率：=[(处理后发酵液的吸光值/未处理发酵液的吸光值)-1]×100%④用离心细胞破碎液观察用离心细胞破碎液观察沉淀模型的方法来确定细胞破碎

5、率，完整的细胞要比细胞碎片先沉淀下来，并显示不同的颜色和纹理。对比两项，可以算出细胞破碎率。二、常用的细胞破碎技术及其应用细胞破碎方式高压匀浆高速珠磨纳米磨破碎撞击破碎渗透压冲击超声破碎冻融法低温玻璃化酶溶法---溶菌酶、纤维素酶等机械法化学法---化学渗透---超临界细胞破碎技术物理法(八)化学渗透法化学渗透法是使用某些有机溶剂(如苯、甲苯)、螯合剂(EDTA)、表面活性剂(SDS、tritonX-100)、变性剂(盐酸胍、脲)等改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成，不同试剂对各种微生物细胞作

6、用的部位和方式有所差异。化学渗透法有利也有弊EDTAEDTA作为螯合剂，可用于处理革兰氏阴性菌(如E．coli)，对细胞的外层膜有破坏作用。革兰氏阴性菌的外层膜结构通常是靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持的，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子将脱落，使外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，导致该区域通透性增强。TritonX-100TritonX-100是非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是内膜的双磷脂层。tritonX—100常与其它试剂混合使用。盐酸胍和脲盐酸胍和脲是常

7、用的变性剂。一般认为胍能与水中氢键作用，削弱了溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能从大肠杆菌膜碎片中溶解蛋白。盐酸胍不仅能改变细胞的通透性，而且能溶解不溶性重组蛋白(如包含体)，并在其它试剂的配合下使其二硫键断裂，变性解离成单体，从而释放出来。除去变性剂和杂蛋白后，在一定条件下恢复肽链内或肽链间的二硫键，再折迭复性成具有活性的蛋白质立体结构。化学渗透法的优缺点优点：①对产物释出具有一定的选择性。例如用0.2mol／L胍处理E.coliC600-1，5h后80％位于胞间质的β-内酰胺酶释放出来，而总的蛋白释放率仅为4％。②细胞外形完整；碎片少