生物分离工程第八章电泳技术

生物分离工程第八章电泳技术

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时间:2019-06-11

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1、电泳技术Electrophoresis本章主要知识点电泳的概念电泳的基本原理电泳技术的分类常用的凝胶电泳技术有哪些?电泳装置的基本组成聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程SDS-PAGE电泳的基本原理及过程琼脂糖电泳的特点及其应用等电聚焦电泳的基本原理双相电泳的概念及其特点学习总体要求掌握电泳概念,电泳速度及凝胶电泳,了解其他几种常见电泳原理及特点,操作及应用。电泳概念ArneTiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者定义——荷电的胶体粒子在电场中的移动;电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层,离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时,电泳现象变得越明显。因此,

2、电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。电泳的简单原理蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。Stoke’sLaw(斯托克斯定律)如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中,使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E,它们与介质的摩擦阻力f相抗衡,这种抗衡服从斯托克斯定律:f=6πrvηv是介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。但实际情况中,f还取决于凝胶厚度、颗粒尺

3、寸、甚至是介质的内渗等。电泳迁移率电泳迁移率(mobility):在电位梯度E的影响下,带电颗粒在时间t中的迁移距离d。其单位是cm2·sec-1·V-1电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础电泳的大致分类依据电泳原理,现有三种形式的电泳分离系统移动界面电泳(movingboundaryelectrophoresis)区带电泳(zoneelectrophoresis)稳态电泳(steadystateelectrophoresis)其中区带电泳是目前常用的电泳系统。区带电泳的主要技术区带电泳中的常用技术载体电泳:粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳无载

4、体电泳:自由电泳、毛细管电泳凝胶电泳作为电泳支持介质必须具有:化学惰性、不干扰大分子的电泳过程,化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。凝胶电泳的支持介质:聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel,PGA)由丙烯酰胺和交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下,聚合而成;琼脂糖凝胶:从琼脂中精制分离出的胶状多糖,其分子结构大部分是由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的;丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的,通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素(引发剂)来引发该过程;以N,N

5、,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下,产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态,经过一系列的自由基反应得到的聚合物;影响聚合的主要因素引发剂和增速剂的浓度:浓度小易导致聚合速度慢;浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变;一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。系统pH值:酸性条件、碱性条件均可,但仍然存在一个最佳pH值,以获得最佳的聚合结果;温度:低温下聚合导致凝胶变脆和混浊;适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性;分子氧:分子氧的存在会阻碍

6、凝胶的化学聚合;抽气系统纯度:金属离子会影响凝胶的聚合;聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应在使用凝胶介质的电泳中,由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力,因此不仅可以防止对流,而且可以把扩散减到最小。凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力(Sizesievingcapacity),这种现象被称为分子筛效应(molecularsievingeffect)分子筛效应图中A,B,C均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为MA=MB>MC,所带电荷量相同QA=QB=QC。ABC+-琼脂糖凝胶的

7、性能、结构与特点其优点如下:琼脂糖凝胶孔径较大,0.075%琼脂糖的孔径为800nm,可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶电泳低。机械强度高:可以在浓度1%以下使用;无毒;染色、脱色程序简单,背景色较低;热可逆性;生物中性:一般不与生物材料结合;电内渗(EEO)大:对于对流电泳有益电泳新介质N-取代聚丙烯酰胺介质:Poly-N-acryl-tris(NAT)gelN-AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)特点:具有极强的水解稳定性具

8、有高度亲水性孔径大电泳系

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