《凋亡检测实验》PPT课件

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1、凋亡检测——DNALADDER——主要内容凋亡概述凋亡检测方法的历史沿革DNALadder实验实验原理实验材料及试剂实验步骤及结果ApoptosisNecrosisApoptosis(KerrandWyllie,1972)Apoptosis•Ageneticallyprogrammed,non-necroticcelldeath.Involvedintissuehomeostasis,celldifferentiation.Playmajorroleinavarietyofdiseases(e.g.Alzheimer,AIDS,heartf

2、ailureandcancer).凋亡与坏死的差别凋亡坏死胞体变小变大胞膜皱缩,形成空泡肿胀,通透性改变结局形成凋亡小体被邻近细胞吞噬细胞崩解,引起炎症反应胞核涉及多个细胞,组织结构被破坏浓缩,DNA断裂成180～200bp或其倍数的片段与其他细胞关系不规则碎裂,溶解通常只影响散在单个细胞,组织结构不被破坏ApoptoticAssay•Morphology•DNAFragmentation•DNALadder•CaspaseActivity•Anti-PARPwesternblot•CellMembraneAlteration•Phosph

3、otidylserineExposureApoptoticAssay•Morphology•DNAFragmentation•DNALadder•CaspaseActivity•Anti-PARPWesternblot•CellMembraneAlteration•PhosphotidylserineExposureendonucleaseGelelectrophoresis700520360180BasepairsDistancebetweencuts=mutipleof180bps180bpsApoptoticDNALadderLane

4、1:MarkerLane2:negativecontrolLane3:DNAofapoptoticcellsLane4:DNAofnecrosiscells金标准实验原理细胞凋亡过程中,可发生特异性级联生化反应,其中最具特色的是内源性核酸内切酶的激活.此酶可作用于连接DNA的核小体间区域,DNA链被切割成180~200bp或其整倍数的片断.抽提DNA,经琼脂糖电泳可见梯状电泳图谱固定：将细胞生前结构和化学物质双重地保存下来，需要先固定。方法：1）物理固定，空气干燥，冻结干燥。2）化学固定，如甲醇，乙醇，丙酮，甲醛等。实验步骤获取凋亡细胞抽提

5、DNA琼脂糖凝胶电泳实验步骤取16g大小的小白鼠,外科手术取胸腺少许洗去血迹放入研磨器中(160目)研磨,边磨边加1640液,获取单个胸腺细胞.将所得混悬液倒入三角烧杯,加入120ml1640液(一般一只小白鼠可获2x106/ml细胞)每孔加入1.2mlDEX(5mg/ml)混匀,co2培养箱,370c,5h取1ml混悬液,加入24孔培养板中将每孔细胞悬液转移至新的Ep管中,3000rpm,5min,去上清,加入70%乙醇700ml混匀.震荡打散细胞,-200c固定过夜离心，3000rpm，5min,去上清（不要回倒，棉棒沾干液体，勿触及沉

6、淀）将上清转入1.5mlEP管，离心12000rpm3min加400ul裂解液，加100ul蛋白酶k,混匀，600c水浴，30-45min100ul饱和Nacl,充分震荡，离心12000rpm3min将上清转入无水乙醇管，颠倒离心管数次可见白色絮状物（DNA）离心12,000rpm，1min，弃上清，并用棉签吸干残留的无水乙醇析出的DNA应成小白点状沉淀于管底，如贴附于管壁，加溶解液时应小心。取凝胶到凝胶成像仪上拍照分析加入20ul溶解液至管中，反复吸打数次至DNA溶解电泳80v,1h吸出20ul已溶解的凋亡细胞DNA，加入到2%琼脂糖凝胶

7、孔电泳1.取出胸腺后,一定要注意将组织去除干净。2.样本须先经70%乙醇固定,以防止DNA降解。3.70%乙醇,无水乙醇应-200c预冷。4．氯仿抽提蛋白时，应用振荡器剧烈振荡，吸移上清时，注意不要将蛋白质层吸动时（宁少勿多，以免蛋白质污染）5．可根据DNA量的多少加样。6.用2%agrose电泳可获较佳分离效果。注意事项实验结果