《荧光分光光度法》PPT课件

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1、第六章荧光分光光度法基本要求：了解荧光光谱法的基本原理和应用特点。了解荧光分光光度计的组成以及特点。掌握荧光光谱法的定量分析方法。了解影响荧光强度的因素。第一节概论回顾：四大类电化学分析法光学分析法色谱分析法其它分析方法原子光谱法分子光谱法X射线光谱法核磁波谱法紫外-可见光分光光度法荧光分光光度法红外吸收光谱法拉曼光谱法一、应用：1.定量分析能产生荧光或能形成荧光配合物的物质。2.简单定性回答“是不是”。二、特点：灵敏度高，比吸收光谱法高10³~104倍。ppb选择性比吸收光谱法好。第二节基本原理一、分子荧光的产生物质吸收光辐射价电子从基态

2、跃到激发态，然后再回到基态释放能量⒈以热能的形式。⒉以光辐射的形式。以光辐射形式释放能量时，发射荧光。这种现象称为光致发光。荧光磷光无辐射跃迁激发态亚稳态（三重态）基态最常见的光致发光：荧光和磷光。两者发光机理不同，寿命不同。荧光寿命10-9～10-6秒，磷光寿命10-3～10秒。荧光可由激发态的分子产生，也可由激发态的原子产生，本章介绍分子荧光。由于荧光的产生由价电子引起，所以，荧光光谱属于电子光谱，其波长范围位于：紫外光区和可见光区。二、激发光谱和发射光谱⒈激发光谱固定荧光波长，以激发光波长对荧光强度(F)所作的光谱曲线。3003504

3、00λ(nm)F【例】硫酸奎宁（0.1mol/L硫酸溶液）的激发光谱。⒉发射光谱固定激发光波长，以荧光波长对荧光强度F所作的光谱曲线。300350400λ(nm)F【例】蒽（乙醇溶液）的发射光谱。三、分子荧光与分子结构的关系分子要产生荧光，首先要能吸收紫外光或可见光。能产生荧光的分子具有的结构特点：共轭双键刚性平面多环结构【例】芴具有刚性平面，产生的荧光比联二苯强。四、荧光强度与浓度的关系Φ：量子效率，发射光量子与吸收光量子之比。I0：入射光强度ε：摩尔吸光系数b：光程c：浓度F=2.303ΦI0εbc公式成立前提条件：εbc=A<0.05

4、即：当试样浓度较低时（c<0.05/εb），C与F方成线性。（如果浓度过高，分子碰撞机会增大，而产生无辐射去激活，造成线性偏离。）第三节荧光分光光度计一、基本结构示意图特点：1．光源方向与检测方向成直角；2．二个单色器。·显示器检测器荧光单色器样品池激发光单色器光源二、主要部件及功能1．光源高压汞蒸气灯，氙灯。能提供紫外光和可见光，光强度比紫外-可见光分光光度计光源大得多。2．激发光单色器作用：提供单波长的激发光。色散元件：棱镜或光栅。出射狭缝宽度可调。3．样品池须用石英材料制成。4．荧光单色器将样品池中的散射光、反射光、杂质荧光等滤掉，只

5、让荧光通过。出射狭缝宽度可调。5．检测器光电转换元件，测定荧光的强度。检测方向与激发光方向垂直：在垂直方向上没有透过光的干扰。由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。第四节定量分析一、定量方法一般采用工作直线法。作C—F直线。FC⑴配制一系列待测成分的标准溶液C1C2C3C4C5⑵测出相应的荧光强度F1F2F3F4F5⑶建立工作直线（F→C）①作图法②回归法⑷测量待测样品，得F样①从工作直线上找到待测成分的浓度C样②由回归方程计算出C样二、影响荧光强度测定的因素1．激发光照射有一些荧光物质若受到强光照射，会发生分解而导致F↓。所以，荧

6、光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。2．温度温度↑，荧光效率下降，F↓。（因为，温度↑，增加分子间碰撞机会而使能量消耗掉。）4．溶剂有些溶剂会使荧光效率下降，也可能带来干扰荧光。苯胺pH7～12时，发兰色荧光。pH﹤2或PH﹥13时，无荧光。【例】所以，有时需要pH缓冲液控制pH值在适当范围内。3．pH值pH值能改变某些荧光物质的电子构型从而影响荧光强度。灵敏度高。可高达ppb级（10-9），甚至ppt级（10-12）。选择性好，与能产生荧光的物质少有关。三、定量分析的特点及应用思考题一、概念（

7、荧光）激发光谱（荧光）发射光谱二、问答题试述分子荧光产生的过程。试述分子荧光强度与浓度的关系式，并说明公式成立的前提条件及原因。分别说明荧光分光光度计两个单色器的作用，以及将光路设计成直角方向的原因。为什么可见光分光光度计的光路是直线方向，而荧光分光光度计的光路是直角方向？荧光分析的激发光谱和发射光谱分别提供了哪些定量分析信息？核黄素的激发光谱（实线）和发射光谱（虚线）如图所示，对核黄素进行荧光定量分析时，最佳的激发光波长和荧光波长各为多少？为什么？