《蛋白质分离、纯化》PPT课件

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1、第七章蛋白质的分离、纯化蛋白质分离、纯化主要依据(1)蛋白质的分子大小透析、超滤、分子筛层析(2)蛋白质的带电特性等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳(3)蛋白质的溶解特性硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离(一)材料1、选材2、破碎3、混合物的分离(二)粗分级(三)细分级采用简单的实验技术手段,比如盐析、等电点沉淀、透析、超速离心等对蛋白质粗提取液进行初步分离纯化,经浓缩后得到蛋白质粗制品。蛋白质粗分级一、盐析盐析:蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出。常用硫酸铵进行沉淀。分级沉淀:通过调节硫酸铵的浓度可以使不同的蛋白质分阶段沉淀下来。优点:价格便宜、蛋白质沉淀

2、完全、溶解过程发热少等。不足:沉淀后蛋白质中含有大量硫酸铵,对后续纯化过程产生不良影响。二、有机溶剂分级沉淀有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等(保持低温),能破坏蛋白质的水化层,使蛋白质的溶解度降低而沉淀。优点:蛋白质沉淀不用脱盐、有机溶剂去除容易。缺点:容易引起蛋白质分子的变性,实验过程严格低温。三、超速离心法在强大的离心力的作用下,溶液中的不溶解的颗粒状物质会沉淀析出,从而使溶液和沉淀物质分开。四、等电点沉淀法在一定的pH条件下,蛋白质所带的净电荷为零,分子之间的静电排斥力最小,因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。Protein的等电点(PI

3、)1、定义:使蛋白质分子所带正电荷与负电荷相等,即净电荷为零时的溶液的pH值称为PI(isoelectricpoint).2、当pH值>PI时,蛋白质带负电荷当pH值

4、聚焦电泳等进一步对蛋白质粗制品分离纯化,以获得高纯度的蛋白质样品,用于蛋白质结构、功能及其应用研究。蛋白质细分级一、凝胶层析又叫分子筛层析。分子筛是具有三维空间网状结构的物质,有天然的,也可人工合成。根据网孔不同可制成不同规格。凝胶层析原理:1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部,随洗脱液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来,所以大分子物质迁移速度快;2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部,所以小分子物质迁移速度慢。具备条件:1惰性,2水不溶性,3能高度水化。常用分子筛:葡聚糖凝胶(Sephadex)型号:G200、G150、G100、G75、G50、G25、G1

5、5分离大蛋白质、小蛋白质,除盐琼脂糖凝胶(瑞典Sepharose、美国Bio-GelA)孔径大,用于分离大分子物质聚丙烯酰胺凝胶(Bio-GelP)带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内,经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图凝胶的前处理溶胀:称取适量凝胶干粉,用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上,待凝胶充分溶胀后,倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗:用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时,然后用蒸馏水洗至中性。酸洗:用0.5MHCl溶液浸泡半个小时,然后用蒸馏水洗至中性。平衡:用起始缓冲液浸泡凝胶,直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。1.将层析柱垂直固定,加入适

6、量溶剂排走空气。2.将平衡好的凝胶搅匀,连续倾入柱中,待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口,让溶剂慢慢流出,继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。3.用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱,使交换剂充分平衡,柱床稳定。装柱样品上柱、洗脱、收集1.如图装好层析装置,打开下端出口,使溶液流出至刚好达到凝胶胶面2.沿柱壁缓慢加入2ml样品,打开下端出口,使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面,再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。3.打开起始缓冲液阀门,连续洗脱。4.用自动部分收集器自动或手动收集,合并同一高峰各管。凝胶的再生及保存再生用过的凝胶经0.5M的NaOH和

7、HCl溶液分别处理后可以恢复其性能凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷二、离子交换层析蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物,所以蛋白质也存在等电点(pI),蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同,取决于所处溶液的pH值。当pIpH时,蛋白质带净正电荷。注意:阳离子交换剂本身带负电荷,阴离子交换剂本身带正电荷。离子交换层析可分为阳离子交换与阴离子交换。1、树脂类:分离氨基酸,孔径小;2、纤维素类:分离蛋白质,孔径大。通过改变盐浓度,辅助改变pH值进行梯度洗脱。阳离子交换层析过程离子交换树脂蛋白质低离子强度洗脱液洗

8、高离子强度洗脱液洗加样平

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