猪乳铁蛋白及其肽在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及生物学功能的初步研究

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1、东北农业大学硕士学位论文猪乳铁蛋白及其肽在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及生物学功能的初步研究姓名：邢婧珉申请学位级别：硕士专业：生物学；微生物学指导教师：唐丽杰2012-06-20摘要乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，分子中含有两个铁结合位点，是两个相似的叶片状结构，分别被命名为N一叶和C一叶，2个叶片分别由一个短肽链所连接，具有抗菌，抗病毒，抗肿瘤，抗氧化，免疫调节和促进肠道有益菌群生长等多种生理功能。乳铁蛋白肽是乳铁蛋白在消化道内经酸性胃蛋白酶水解后的小肽，它位于乳铁蛋白N．叶中的17～42氨基酸残基之间，其功能与乳铁蛋白的功能密切相

2、关，除不能结合铁离子外，乳铁蛋白肽几乎具备乳铁蛋白的所有生物学活性，并且杀菌活性比乳铁蛋白高。由于乳铁蛋白的广泛生物学功能，同时其来源受限，因此以基因工程技术生产乳铁蛋白及其肽是其在生产中应用的主要趋势。本研究为获得猪乳铁蛋白及其肽的基因工程表达，选用真核表达系统——巴斯德毕赤酵母为宿主菌，以组成型表达质粒pGAPHctM作为表达载体，构建无需诱导表达的重组酵母菌株。根据NCBI数据库公布的牛、羊、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列和相关文献报道，运用EXPASY在线网站，对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行了理化性质分析

3、，并参照巴斯德毕赤酵母使用密码子的偏好性，优化设计并合成了138bp的编码46个氨基酸的猪乳铁蛋白肽的LFcinP基因；同时用本实验室保存的天然猪乳铁蛋白N．叶基因扩增95lbp的片断，共编码319个氨基酸的猪乳铁蛋白N．叶，命名为pLF．319，通过pGAPHotM酵母组成型分泌表达载体将LFcinP和pLF．319分别整合到巴斯德毕赤酵母GSl15菌株基因组上，获得了表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因的重组酵母菌株pGAPHotM．LFcinP／GSll5和表达pLF．319基因的pGAPHc【M．pLF．319重组菌株；SDS

4、．PAGE和Western．blot分析表明分别表达了约5．4kDa的猪乳铁蛋白肽LFcinP和约35kDa的pLF．319重组蛋白；用Bandscan软件分析96h的pGAPHaM—LFcinP／GS15和pGAPH心／I—pLF一319／GS15的浓缩上清蛋白电泳带，结果表明重组蛋白LFcinP占重组巴斯德毕赤酵母pGAPHaM．LFcinP／GSl15上清蛋白的35．9％，表达量约48．5吲mL；重组蛋白pLF．319占巴斯德毕赤酵母pGAPHoJVI．pLF．319／GSll5上清蛋白的6．9％，表达量约为9．18gg／m

5、L。动态生长曲线法抑菌试验结果表明重组猪乳铁蛋白肽LFcinP和乳铁蛋白N．叶pLF．319对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureasCVCC25923株和革兰氏阴性菌大肠杆菌EscherichiacoliCVCCl0141均有一定的抑菌作用。以断乳BALB／c小鼠为模型动物，将断乳小鼠分为4组，每组12只，不同组分别口服饲喂PBS缓冲液，GSll5上清，重组菌pGAPHoJVI．LFcinP／GSll5上清，重组菌pGAPHmM．pLF．319／GSl15上清，每日以饮水的方式进行饲喂，每日饲喂8h水，

6、剩余16h不同组别分别饮用PBS、GSll5上清，pGAPHoJM-LFcinP／GSll5上清、pGAPHo．M-pLF．319／GSll5上清液，连续21d，检测重组猪乳铁蛋白及肽能否提高断乳小鼠对鼠粮的利用率，促进断乳小鼠生长，以及对血清生化指标的影响情况。对各组断乳小鼠的每日进食量、饮水量、断乳小鼠的体重和身长进行了测量，结果表明口服重组菌的实验组鼠粮利用率分别为14．8％(pGAPHaM-LFcinP／GS1l5组)和12．7％(pGAPH02vl—pLF．319／GS15组)，高于对照组未重组酵母菌GSll5上清组(1

7、0．6％)和PBS组(8．72％)；身长测定结果表明，服用重组菌平均身长增长量为5．57Gm(pGAPHctM-LFcinP／GSll5组)和5．79gm(pGAPHo．M．pLF．319／GSll5东北农业大学理学硕士学位论文组)高于PBS组(4．5cm)和GSll5组(4．25cm)；血清检测结果表明，与PBS和GSll5上清对照组相比口服LFinP和pLF．319组提高了总蛋白含量和血清球蛋白的含量伊<0．05)；不同组别之间，总胆固醇，葡萄糖浓度均未产生显著差异，LFcinP组和pLF．319组显著提高了总胆红素水平，直接

8、胆红素水平和间接胆红素水平(P<0．05)；各处理组之间碱性磷酸酶未产生显著差异，与PBS组和GSll5组相比LFciTlP组和pLF．319组谷丙转氨酶活性显著降低伊