《负染色技术》PPT课件

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1、第六章负染色技术第六章负染色技术一、基本概念1.正染色:(positivestaining)阳性反差，利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。特征：明场,背景亮,材料深暗2.负染色:(NegativeStaining)阴性反差染色，某些高电子密度的物质去包围低电子密度的样品,在黑暗的背景上,反衬出明亮的样品形貌。特征：暗场,背景深暗,材料亮样品染料铜网负染色原理图1.优点：⑴提高了样品的分辨率和反差高。分辨率取决于染色剂颗粒的大小，颗粒直径约D=7Å时，＝10～15Å，最高＝5～7Å。

2、⑵常用、简易、快速、不要求高纯度的样品制备技术，且用量少⑶不改变生物活性，即不因染色造成样品变形。二、负染色的特点2.缺点：⑴负染原理不清楚，结果不稳定，规律性、重复性差。(操作时，因样品的种类、染色液浓度、pH值变化常难以掌握。)⑵负染色技术只能观察样品表面形貌，内部结构看不清楚。三、应用1、按研究样品分:观察和研究细菌、原生动物、生物大分子、亚细胞碎片、分离的细胞器、蛋白质晶体、病毒病原物2、按研究方向分:免疫学、细胞化学1、密度反差原理：2、异常反差原理：PTA染液样品氧化镁四、负染原理：五、负染色样品的制备颗粒状悬浮样品1、植物病毒浸出法（浓度>105个/ml

3、）针刺法2、细胞培养物3、动物组织培养物浓缩以增加病毒的检出率六、负染色剂1、对染色剂的要求：⑴、高电子密度，电子散射能力强⑵、熔点高，电子照射不升华⑶、溶解度大，不析出沉淀⑷、本身无结构，与样品不发生化学反应⑸、分子小，易于渗透到不规则表面的凹陷处。2、常用的染色剂⑴磷钨酸类KPT，NaPT，PTA优点：适于大多数样品,,颗粒细腻,反差好,图像背景干净、杂质少常用1～5％溶液，pH＝6.8～7.4缺点：显示样品的结构细节较差，对某些病毒易产生破坏作用。⑵醋酸铀（醋酸双氧铀）UO2(CH2COO)22H2OpH＝4.0～5.2，0.5～4％水溶液优点：显示病毒细节好，

4、反差强，对样品破坏小缺点：颗粒性杂质多，当pH>6.0产生沉淀而失效，见光分解⑶甲酸铀：0.5～1%水溶液，pH=4.0-5.2,不稳定，现配现用⑷钼酸铵：1～3％水溶液或醋酸铵溶液，pH=4.0～9.0反差小，性能稳定，适于有界膜的生物样品⑸硅钨酸：1～2％，中性偏碱下使用1.滴染法:(悬滴法)低浓度的病毒样品可获得较好效果滴样→滴染液→漂洗七、负染色方法：2.喷雾法优点：样品在膜上分布均匀，雾滴小缺点：操作繁琐，样品用量大，混合时易产生沉淀。3.漂浮法：①沾样②吸取多余液体③滴染液理想的负染色样品图象：均匀,没有边缘效应,反差良好,柔和１、样品纯度：适当提纯，杂质

5、不宜太多，特别不应有过多的糖类２、样品浓度适宜：高浓度：样品堆积、重叠低浓度：寻找困难３、样品分布均匀A、使用分散剂：B、亲水处理：八、影响负染效果的因素4、样品悬液和染液pH的问题pH＝6.7～7.25、染色的时机不干不湿，存放时间不宜太长6、用双蒸水充分漂洗7、观察时用小孔径的光阑，提高反差番茄黑环病毒病毒荚膜：未处理病毒荚膜：负染色病毒荚膜：旋转投影病毒荚膜：金属投影人类腺病毒在人胚肾细胞核内的晶格排列腺病毒负染色粘液病毒－－流感病毒http://www.shkp.org.cn/upload/html/2003042818412/feidian3.htmSARS

6、病毒负染色1968年，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形状类似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒。1975年国家病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒分为冠状病毒和环曲病毒两个属。作业1.名词解释：电子染色负染色2.简述负染色的优缺点及应用范围3.对负染色剂的有何要求？常用的负染色剂有哪些？4.负染色常用方法有哪些？5.影响负染效果的主要因素有哪些？