分解尿素的细菌的分离和计数

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数课题2微生物的培养与应用一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+CO2NH3+H2O3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.

2、筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照1、实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的TaqDNA聚合酶。㈠.筛选菌株要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；配置合适的培养基方法：⑴抑制大多数微生物生长⑵造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布

3、平板法等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属于哪类培养基？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素选择培养基培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素

4、作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、培养基选择分解尿素的微生物的原理选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；有时候需要染色缺点2.间接计数法（1）常用方法：当样品的稀

5、释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。（2）原理：稀释涂布平板法。二.实验的具体操作㈠.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量

6、不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板[三]样品的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。㈣.取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——30

7、0的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀

8、释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为了减少误差可将同一稀释度涂布三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。微生物的培养与观察三.结果分析与评价1.通过对照实验，若培养物有