第五章 固定化酶4

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1、第五章固定化酶及酶反应器（ImmobilizedEnzymeandReactorsforenzymaticcatalysis）Contentsofchapter5五、固定化酶的应用四、固定化酶反应器三、固定化酶的性质二、固定化酶制备一、固定化酶发展简史GoGoGoGoGo2问题：酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。办法：将水溶性酶或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶或细胞。固定化酶:固定在载体上，并在一定

2、范围内进行催化反应的酶。一、固定化酶发展简史341953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。5二、固定化酶的制备(一)吸附法（二）包埋法（三）共价结合（偶联）法（四）交联法（五

3、）四种固定化酶制备方法的特点小结（六）固定化方法与载体的选择6Methodsofimmobilization7(一)吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。8根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附法(physicaladsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原

4、以及火棉胶等有机吸附剂。9离子结合法(ionbinding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如AmberliteXE-97、DoweX-50等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。101.影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓

5、度增加，吸附量也增加，直至饱和。温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。11优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-SephadexA-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。2

6、.吸附法的优点、缺点12（二）包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法成为包埋法。131、凝胶包埋法（胶格包埋法）：将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。14海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化，操作简单经济。K-角

7、叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。胶原和明胶也是常用的包埋载体。152、微囊化包埋法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用。微囊制备方法（1）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。（2）界面聚合法是将亲水性单体和疏水性单体利用界面聚合的原理包埋酶的方法。所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化

8、学反应而失活。（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。1617优点：在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。缺点：是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网