实验二 血清总蛋白测定(双缩脲法)

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1、实验二血清总蛋白测定（双缩脲法）血清总蛋白是血清中所有蛋白质的总称，正常人含量为60-80g/L。按不同的分离方法可将血清蛋白质分为不同的组分。从目前临床生化实际应用上，血清总蛋白分为清蛋白和球蛋白两大类，其中球蛋白又分为α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白四种。正常成人每天所合成的血清蛋白质中，清蛋白及大部分α1、α2、β球蛋白是肝脏合成的，γ球蛋白（大部分是免疫球蛋白）则主要来源与浆细胞。总蛋白测定，一般利用下列四种蛋白质的结构或性质进行：重复的肽键结构；酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外吸收；与

2、染料的结合能力；沉淀后借浊度或光折射测定。目前临床应用最广泛的方法是利用蛋白质分子中的多个肽键与双缩脲试剂显色法。【目的】1.熟悉血清总蛋白测定的原理及基本操作。2.掌握血清总蛋白测定的临床意义。【原理】蛋白质分子中的肽键（-CONH-）在碱性条件下能与Cu2+作用形成紫红色络合物。此呈色反应与双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与Cu2+作用产生紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。反应中溶液颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用分光光度法定量检测蛋白质的含量。凡具有两个以上肽键结构的化合物均

3、有此反应，因此双缩脲反应广泛用于肽及蛋白质定性、定量检测。【器材】恒温水浴箱、分光光度计、刻度吸管、微量移液管、试管、试管架。【试剂】1．6mol／LNaOH溶液 称取NaOH（优级纯）240g，溶解于新鲜蒸馏水中并加至1000ml。置聚乙烯瓶内盖紧室温保存。2.双缩脲试剂 精确称取结晶硫酸铜(CuSO4·5H20)3.0g，酒石酸钾(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g，碘化钾(KI)5.0g，用500m1新鲜蒸馏水溶解。在搅拌下，加入6mol／L氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水稀释至1000ml。置

4、聚乙烯瓶内盖紧室温保存。3．70g/L蛋白标准液 可用商品血清蛋白标准液，也可收集混合新鲜血清用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，加叠氮钠防腐，冰冻保存。4.154mmol/L氯化钠溶液称取氯化钠0.9g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。【操作】取3支试管，按表3-2操作。表3-2血清总蛋白测定加入物（ml）测定管标准管空白管血清0.1－－蛋白标准液－0.1－154mmol/L氯化钠溶液0.40.40.5双缩脲试剂5.05.05.0充分混匀，置37℃水浴中10分钟（或25℃30分钟），在540nm波长处进行比色，

5、以空白管调零，读取各管吸光度。【计算】【正常参考范围】60～80g/L【注意事项】1．由于各种蛋白质的分子量不同，故其浓度不宜用mol/L表示，而用g/L表示。2.试管、吸管应清洁，否则会有混浊现象出现。3.高脂、黄疸和溶血标本应作血清空白对照，以保证结果准确。含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可用乙醚3ml抽提后再进行比色。【临床意义】1.血清总蛋白降低（1）合成障碍：肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，其中以清蛋白下降最为明显。（2）丢失过多：见于严重烧伤时大量血浆渗出，大失血，肾病综合征时大量

6、蛋白尿，溃疡性结肠炎时肠道长期丢失一定量的蛋白质等。（3）营养不良或消耗增加:长期低蛋白饮食、慢性胃肠道疾病所引起的消化道吸收不良，使体内缺乏合成蛋白质的原料，或长期患消耗性疾病，如结核病、恶性肿瘤、甲状腺功能亢进等均可引起血清蛋白浓度降低。（4）血液稀释：静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。2.血清总蛋白增高（1）血液浓缩：急性失水（严重腹泻、呕吐、高热等），休克（毛细血管的通透性增加），慢性肾上腺皮质功能减退,急性失水尿钠增多引起继发性脱水。（2）合成增加:主要是球蛋白合成增加，如多发性骨髓瘤。

7、【结果及分析】【思考题】1.蛋白质常见的呈色反应有哪些？2.微量凯氏定氮法测定蛋白标准液浓度的理论依据是什么？