20071016-质粒dna的提取及定量定性分析

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1、Q&A关于PCR结果分析关于产物回收①漂洗作用：换缓冲液，除杂②乙醇：保存目的产物③离心：去乙醇，除液体，保证后续工作④补救：勿轻易弃置；高盐结合，重复漂洗。关于…………123456M789101112Fig.1AgaroseElectrophoresisanalysisofthePCRproducts.Lane1～Lane12：productsofPCRM：DNAmarker（fromtoptobottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）引物或其二聚

2、体问题：①10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热启动不够？回收，重新电泳鉴定。②1、12泳道：未加引物或模板。相邻泳道溢出污染非特异性！Good！！PCR仪中的位置边缘效应？！胶融！外溢胶融！质粒DNA的提取及其定性定量分析基因的克隆与表达专题之二主要内容一、质粒DNA提取二、琼脂糖电泳鉴定及半定量三、紫外吸收定量及纯度检测基本原理结构差别分子量差别变性－复性SDS碱裂解碱裂解Ⅱ碱变性一、质粒DNA的提取流程接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mLLB羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug

3、/mL）液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜4000rpm、离心1min，收集所有菌体150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清接菌培养收菌碱裂解Ⅰ加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心10min上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min复性回收纯化上清加2

4、倍体积的无水乙醇（旋涡混匀），室温30min12000rpm，离心10min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心5min沉淀于超净台中风干（5min～20min）沉淀加入20uLRTE，600C水浴30分钟溶解-200C保存醇沉回收溶解保存离心标识碱裂解Ⅰ溶液Ⅰ冰浴pH8.0剧烈振荡10min溶液粘稠混浊碱裂解Ⅱ溶液Ⅱ现用现配切勿振荡！颠倒混匀T≤5minSDS包被！！复性回收溶液Ⅲ冰上预冷切勿振荡！颠倒混匀15min仅质粒复性？在哪相？！！制胶：1%琼脂糖（2

5、0mL，1xTAE)缓冲液：1xTAE，130mL制样：质粒DNA2μL10xloading0.5μLMarker：5μL电泳：80伏恒压结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量二、质粒DNA的电泳测定流程：质粒DNA稀释100倍（用TE缓冲液稀释），总体积300μL检测波长：定量：C=OD260*50*稀释倍数（μg/mL）纯度指标：三、质粒DNA的紫外吸收检测260nm－核酸280nm－蛋白OD260/OD280比值范围：…………≥1.8～2.0≥……污染成分：蛋白,酚质粒DNARNA下次实验的简介与准备

6、DNA重组－酶切和连接基因的克隆与表达专题之三预习：在实验中如何进行对照？思考：工程菌的常用种类及用途？质粒的种类及特性？分子生物学中常用的内切酶？连接酶？抗生素种类？为什么应用抗生素？灭菌：1mL、200μL、10μL枪头各一盒1.5mL小指管40个加油啊！20001000750500200100M123456789C关于PCR退火条件摸索