牛奶中成分分析.doc

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1、牛奶中部分成分的分析一、实验目的（1）学习利用等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白（2）掌握双缩脲法测定蛋白质的原理和方法（3）熟悉可见光分光光度计的操作（4）加强对沉淀、抽滤、溶液配制等基本操作的锻炼（5）分析牛奶中蛋白质与钙的含量。（6）掌握配位滴定法测定液体食品中钙含量的原理和方法（7）通过与牛奶包装上注明的含量比较，对实验分析结果进行客观评价二、实验原理牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，加入醋酸将牛乳的pH调至4.7时，使酪蛋白沉淀出来。

2、用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质，抽滤、纯化后便可得到纯酪蛋白。双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。钙与身体健康息息相关，钙除成

3、骨以支撑身体外，还参与人体的代谢活动，它是细胞的主要阳离子，还是人体最活跃的元素之一，缺钙可导致儿童佝偻病，青少年发育迟缓，孕妇高血压，老年人的骨质疏松症。缺钙还可引起神经病，糖尿病，外伤流血不止等多种过敏性疾病。补钙越来越被人们所重视。牛奶中含有易被人体吸收得钙，有些牛奶产品中还特地加钙而成为钙奶。对于液体牛奶中钙的含量，可采用EDTA法进行直接测定。考虑到牛奶中含有Fe3+、Al3+等干扰离子，可以加入少量三乙醇胺以消除它们的，调节pH≈12～13，以铬蓝黑R作指示剂，指示剂与钙生成红色的络合物，当用EDTA滴定至计量点时，游离

4、出指示剂，溶液呈现蓝色。三、材料、试剂与仪器（一）材料新鲜牛奶、加钙牛奶（二）试剂95%乙醇、无水乙醚、醋酸、醋酸钠、NaOH、CuS04·5H2O、酒石酸钾、碘化钾、牛血清蛋白（BSA）、EDTA、基准物质CaCO3、HCl、三乙醇胺、铬蓝黑R、盐酸羟胺、邻二氮菲（邻菲啰啉）、浓硝酸、硫代硫酸钠、甲基红、氨水1.、0.2mol·L-1pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液先配A液与B液。A液：0.2mol/L醋酸钠溶液。B液：0.2mol/L醋酸溶液。取醋酸钠固体1.64g加水溶解并稀释至100ml，取冰醋酸1.37mL加水稀释至120ml

5、，取A液94.79mL，B液105.21mL,混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液200mL。2、乙醇—乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（V/V）3、NaOH（6mol·L-1）：称取12g氢氧化钠溶于50mL水中。4、双缩脲试剂：称取CuS04·5H2O3.0g，酒石酸钾9.0g和碘化钾5.0g，分别溶解后混匀，加6mol·L-1NaOHl00mL，最后加水至1000mL，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。5、0.9％NaCl6、蛋白质标准液(10mg·mL-1)，用小烧杯称取干燥的牛血清蛋白100.0mg，以少量生理盐水溶解后倒

6、入l0mL容量瓶中，淋洗小烧杯数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线。7、待测蛋白样本：将牛奶样品用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定；将制得的酪蛋白用生理盐水准确配制成一定浓度的溶液后再测定。（如若不能溶解，滴加几滴6mol/LNaOH溶液、分别用l0mL容量瓶定容）8、EDTA(0.01mol·L-1)：称取2.0gEDTA二钠盐，用温热水溶解后，稀释至500mL，储存于聚乙烯塑料瓶中。9、CaCO3标准溶液(0.01mol·L-1)：准确称取基准物质CaCO30.1g左右，先以少量水润湿，再逐滴小心加入6mol·

7、L-1HCl，至CaCO3完全溶解，定量转入100mL容量瓶中，以水稀释至刻度，并计算其浓度。10、NaOH（5mol·L-1）11、HCl（6mol·L-1）12、三乙醇胺(200g·L-1)13、铬蓝黑R(5g·L-1)乙醇溶液（三）仪器试管、移液管（1mL、5mL、20mL）、、l0mL容量瓶、烧杯、表面皿、250mL锥形瓶、1000mL棕色试剂瓶、25mL具塞比色管、试管架、坩埚、60mL分液漏斗水浴箱、可见光分光光度计、离心机、抽滤装置、精密pH试纸（可测pH4.7），酸度计、电炉、温度计四、操作步骤（一）牛奶中酪蛋白的提

8、取1、酪蛋白的粗提50mL鲜牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液50mL用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000r·min-1）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。