实验五.细菌总dna提取方法

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1、实验五细菌总DNA提取方法100412一、实验目的：掌握细菌总DNA提取的方法二、实验原理：根据细菌DNA和蛋白质、糖类和脂类的特性的不同，分离出总DNA三、实验用品;溶液制备：母液：1）1.0MTris-HCl,称取60.57gTris（TrisAmino），溶于500mlddH2O中，用HCl调整pH8.0；2）0.5MEDTA，称取37.32gEDTA-Na，溶于100mlddH2O中，用NaOH调整pH8.0。STEbuffer（pH8.0）：100mMNaCl，10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0；高压灭菌，4℃保存。TEbuffer

2、(pH8.0)：10mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。取5ml1mol/LTris-HCl母液，1ml0.5mol/LEDTA母液，置于400ml的ddH2O中，然后定容到500ml，高压灭菌后，4℃保存备用；四、实验步骤：1、取1ml液体培养的菌体（Gram-negativeorGram-positivebacteria），离心8000rmp2min；（肺炎克雷伯氏杆菌需离心13000rmp10min，以沉淀细胞）2、弃上清，用400ulSTEbuffer清洗两次，每次离心8000rmp2min（肺炎克雷伯氏杆

3、菌需离心13000rmp10min，以沉淀细胞）3、弃上清，加入200ulTEbuffer悬浮沉淀；4、加入100ulTris饱和酚（Tris-saturatedphenol，pH8.0）;振荡器振荡60-120S，以裂解细胞；注：M.MB200振荡120S,E.coli振荡60S.5、4℃，离心13000rmp5min，以将水相（aqueousphase）从有机相（orangicphase）中分离出来；6、取160ul上层水相，转移至另一个1.5mlEp管中；7、加入40ulTEbuffer，以达到200ul体积，再与100ul氯仿（chloroform）混

4、合，可用1ml移液抢吹打；8、4℃，离心13000rmp5min；9、用氯仿抽提裂解液，直到白色的界面（whiteinterface）消失，重复2-3次；10、将160ul上层水相移入一干净的1.5ml的Ep管中；11、加入40ulTEbuffer，5ulRNase（10mg/ml），37℃保温10min；12、加入100ul氯仿，混匀，4℃，离心13000rmp5min；13、将150ul上清水相移入另一个1.5mlEp管中，-20℃保存。Refences：Hai-RongCheng,NingJiang,ExtremlyrapidextractionofDN

5、Afrombacteriaandyeasts,BiotechnologyLetter,2006,Vol.28,p55-59;Wen-pingChenandTsong-tehKuo，AsimpleandrapidmethodforthepreparationofgramnegativebacterialgenomicDNA；NucleicAcidsResearch,1993,Vol.21（9）,p2260;