DB12T 651-2016 转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测 实时荧光PCR方法

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1、ICS67.050B23DB12天津市地方标准DB12/T651—2016转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测实时荧光PCR方法Detectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—QuanlitativePCRmethodforherbicide-resistantsoybeanGTS40-3-2anditsderivates2016-09-27发布2016-11-01实施天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T651—2016前言本

2、标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市质量技术监督宝坻检测中心。本标准主要起草人：兰青阔、宛煜嵩、杨炳存、赵新、李亮、陈锐、朱珠、刘娜、王成、徐石勇。本标准2016年9月首次发布。IDB12/T651—2016转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测实时荧光PCR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2转化体特异性定量PCR检测方法的术语和定义、检测方法

3、、结果计算。本标准适用于转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种，以及制品中GTS40-3-2转化体的定量PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品检测抽

4、样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1Lectin基因Lectingene编码大豆凝集素的基因。3.2GTS40-3-2转化体特异性序列event-specificsequenceofGTS40-3-2GTS40-3-2外源插入片段5′端与大豆基因组的连接区序列，包括35S启动子部分序列和大豆基因组的部分序列。4原理根据大豆外源基因和内标基因特异性序列设计引物和TaqMan荧光探针，对标准样品和试样同时进行实时荧光PCR扩增。根据标准样品模板拷贝数与Ct值间的线性关系，分别绘制外源基因和内标基因的标准曲线。

5、计算试样中外源基因和内标基因的拷贝数及其比值。5检测方法5.1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1.1TaqMan荧光PCR反应试剂盒。1学兔兔www.bzfxw.comDB12/T651—20165.1.2引物和探针。5.1.2.1Lectin基因。lec-1215F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′lec-1332R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′lec-1269P：5′-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTT

6、CAC-3′预期扩增片段大小为118bp（参见附录A）。5.1.2.2GTS40-3-2转化体特异性序列。GTS40-3-2F：5'-CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG-3'GTS40-3-2R：5'-GACTTGTCGCCGGGAATG-3'GTS40-3-2P：5'-CGCAACCGCCCGCAAATCC-3'预期扩增片段大小为121bp（参见附录A）。用水分别将上述引物和探针稀释到10µmol/L，探针需避光保存。5.2仪器分析天平：感量0.1g和0.1mg；荧光定量PCR扩增仪；核酸定量仪；重蒸

7、馏水发生器或纯水仪；其他相关仪器设备。5.3分析步骤5.3.1抽样按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定执行。5.3.2试样准备按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013规定执行。5.3.3试样预处理按农业部1485号公告—4—2010规定执行。5.3.4DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010规定执行。5.3.5标准曲线样品制备采用相同的标准样品绘制GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的标准曲线。提取GTS40-3-2标55准物质基因组DNA，用0.1×TE或水稀

8、释至1×10-5×10copies/µL（相当于20-100ng/µL），作为初始模板。然后再用0.1×TE梯度稀释初始模板，制备不同浓度的GTS40-3-2标准溶液。标准溶液至少涵盖5个GTS40-3-2浓度梯度，最低浓度拷贝数小于200，最高浓度拷贝数大于40000。5.3.6PCR反应5.3.6.1标准样品和试样实时荧光PCR反应同时进行