酵母双杂交教学教材.ppt

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时间:2020-11-28

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1、酵母双杂交转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)这两个结构域各具功能,互不影响,单独存在时都没有转录激活的功能,只有二者在空间上充分接近时,才表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。二、酵母双杂交系统的建立Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子,天然的Gal4分子是由一条由881个氨基酸残基组成的多肽链。两个结构域中的DNA-BD由位于N-末端的1~147位多肽构成,能识别位于Gal4基因的上游激活序列(upstreama

2、ctivationsequence,UAS)。AD由位于C-末端的768~881位多肽构成。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上,只要它们在空间上充分接近,则能恢复Gal4作为转录因子的活性。酵母Gal4的结构1147768881DBD(DNA-bindingdomain)(AD)ActivationDomainDBD(DNA-bindingdomain):DNA结合结构域AD(activationdomain):转录激活结构域Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上,一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融

3、合;另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中,SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶,SNF4是它的一个结合蛋白,这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后,通过SNFl与SNF4的相互作用,Gal4的DNA-BD与Gal4的AD靠近,形成一个大的复合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可识别位于Gal4效应基因的UAS,并可与之结合;Gal4的AD则可与转录复合物中其他成分结合,激活UAS下游报告基因LacZ的转录。酵母转录

4、因子(Gal4)与BD-fusion---诱饵蛋白(baitprotein)与AD-fusion---猎物或靶蛋白(preyortargetprotein)报告基因(reportergene)---LacZ(编码β-半乳糖苷酶)酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:易于转化、便于回收扩增质粒具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合报道株经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。三、酵母双杂交系统的原理可通过检测报告基因的转录与否来研究蛋白质X和Y的相互作用。酵母Gal4基

5、因转录表达Gal4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)结合,而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。钓饵蛋白目的蛋白(靶蛋白)假设将X、Y蛋白分别与转录因子的DBD和AD融合产生新的融合蛋白。酵母双杂交载体及菌株共转化至酵母菌株如果这两个蛋白能够互相作用,则该相互作用会促使DBD和AD互相靠近而产生有活性的转录因子,进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。酵母双杂交系统的报告基因通常由一些营养选择标记(如HIS3基因的转录激活能使酵母在缺乏组氨酸的培养基上生

6、长)或编码酶的基因(MEL1基因的转录激活能使酵母产生a-半乳糖苷酶)组成。检测LacZ活性阳性克隆可诱导产生高水平的ß-半乳糖苷酶。该酶在X-gal存在的情况下现色反应呈蓝色。筛选四、酵母双杂交系统的优点高敏感性。检测的结果是基因表达产物的累积效应,可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。真实性。检测在活细胞内进行,作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上代表细胞内的真实情况。简捷性。融合蛋白相互作用后,减少了制备抗体和纯化蛋白质等的繁琐步骤。广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库,能分析不同亚细胞部位和

7、功能的蛋白质,适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。五、酵母双杂交的应用酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明,酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。1、发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已成为发现新基因的主要途径。用已知基因作诱饵

8、,利用酵母双杂交系统在选定的cDNA文库中筛选与其相互作用的新蛋白,再从酵母中分离得到AD-Library载体,对其进行测序并在GenBank中进行比较,可以得到与已知基因在生物学功能上的联系。另外,也可作为研究已知基因

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