酶的提取纯化与活力测定精讲课教案.ppt

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1、酶的提取纯化与活力测定精B.材料的获取在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。一.酶的分离与提取酶提取基本的方法C.酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤为：抽提、纯化、结晶抽提：破碎细胞，动植物组织一般可用组织捣碎器；或者加石英砂研磨，将材料做成丙酮粉或进行冰冻融解；对细菌，常采用加砂或加氧化铝研磨和超声波振荡方法破碎。大多数酶一般都用缓冲液进行抽提，缓冲液的类型决定于酶的种类和理化特性，抽提液pH最好远离等电点。一.酶的分

2、离与提取酶提取基本的方法C.酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤：抽提、纯化、结晶浓缩：抽提液或发酵液中酶浓度往往很低，必须浓缩富集。常用的浓缩方法有：加中性盐或冷乙醇沉淀后再溶解，胶过滤浓缩以及超过滤浓缩法等。纯化：纯化过程就是去除杂质的过程。原则：一方面是要提高酶的纯度，另一方面却也使酶的总量不可避免有所损失。一.酶的分离与提取酶提取基本的方法C.酶分离纯化的主要步骤1.主要步骤为：抽提、纯化、结晶结晶：浓缩液经过各种方法的纯化，可得到较纯的结晶产品。一.酶的分离与提取酶提取基本的方法C.酶分离纯化的主要步骤2.选择分离纯化方法a.盐析法（如硫酸胺）b.有机

3、溶剂沉淀法c.层析纯化法（葡聚糖凝胶、阴离子交换层析）d.等电点法e.吸附分离法一.酶的分离与提取酶提取基本的方法1.酶活力概念酶活力是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。二.酶活力及其测定但是，酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。二.酶活力及其测定1.酶活力概念如何测定酶活力？以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反应速度曲线0产物浓度时间注意：初速度的测定是关键，为什么？二.酶活力及

4、其测定1.酶活力概念可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着时间的延长，反应速度逐渐下降产物浓度时间0原因底物浓度的降低、产物的增加造成的逆反应的加快产物的抑制作用酶本身逐渐失活二.酶活力及其测定1.酶活力概念常用的酶活力单位有三种：A.国际单位(IU)这种单位是由国际酶学委员会规定的。在标准条件(25℃、最适pH、最适底物浓度)下，酶每分钟催化1mmol底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位(IU)。2.酶活力与单位二.酶活力及其测定B.Katal是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位在最适条件下，酶每秒钟催化1mol

5、底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个Kat。1Kat=60×106IU2.酶活力与单位2.酶活力与单位二.酶活力及其测定C.自定义的活力单位这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。酶习惯上或测定时使用的反应速度的单位定义为酶的活力单位。有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化(DA/t)表示酶活力单位。2.酶活力与单位2.酶活力与单位二.酶活力及其测定指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数比活力是酶制剂纯度的常用指标——比活力越大，表示酶越纯比活力＝酶活力单位数（U）酶蛋白质量（mg）3.酶的比活力二.酶活力及其

6、测定纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产率(回收率)=每次总活力/第一次总活力×100%4.酶的纯度二.酶活力及其测定1.某酶在一定条件下，5min内使30mmol底物转变为产物，问该酶的活力（IU）是多少？2.从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白质，总活力为360单位。经过一系列纯化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白)，总活力为288单位。请问回收率是多少？纯化了多少倍？4.酶的纯度二.酶活力及其测定不同样品同一酸制剂的总活力、总蛋白、比活力比较4.酶的纯度二.酶活力及其测定纯化进程甲乙丙丁总活力6432总蛋白(mg

7、)201052比活力(U/mg)6/204/103/52/2此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢