阿立哌唑、喹硫平与P糖蛋白相互作用机理研究

阿立哌唑、喹硫平与P糖蛋白相互作用机理研究

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1、中南大学博士学位论文阿立哌唑、喹硫平与P-糖蛋白相互作用机理研究姓名:李坤艳申请学位级别:博士专业:药理学指导教师:李焕德20070501博士学位论文中文摘要阿立哌唑、喹硫平与P一糖蛋白相互作用机理研究摘要一、目的通过研究阿立哌唑、喹硫平对P.糖蛋白功能、表达的影响和P.糖蛋白对阿立哌唑、喹硫平转运的影响,探讨阿立哌唑、喹硫平与P.糖蛋白相互作用的机理。二、方法’1.阿立哌唑、喹硫平对P一糖蛋白的作用研究方法(1)细胞培养及Caco-2单层细胞模型建立,为阿立哌唑、喹硫平对P一糖蛋白功能和表达的作用研究提供P一糖蛋白载

2、体细胞和阴性对照细胞,同时为研究P一糖蛋白对阿立哌唑和喹硫平的作用提供转运模型。Caco-2细胞和ECV304细胞均采用DMEM高糖培养基进行常规培养,细胞荧光免疫法进行P一糖蛋白表达验证;建立Caco-2细胞单层模型采用transwell板接种细胞,用细胞电位仪、萤光黄及普奈洛尔转运实验进行模型验证。(2)采用MTT法和活细胞计数法确定喹硫平和阿立哌唑的体外最大无毒浓度,为阿立哌唑、喹硫平对P一糖蛋白功能和表达的作用研究及P-糖蛋白对阿立哌唑和喹硫平的作用研究提供与细胞作用的最大浓度,保证细胞活力。博士学位论文中文摘

3、要(3)阿立哌唑、喹硫平对P一糖蛋白功能的影响以ECV304细胞作为P一糖蛋白表达的阴性对照细胞,维拉帕米作为P.糖蛋白功能抑制的阳性对照,使用荧光分光光度法和流式细胞术分析阿立哌唑、喹硫平对P.糖蛋白底物一罗丹明123在Caco.2细胞中外排的影响。(4)从mRNA水平和蛋白水平研究阿立哌唑、喹硫平对P.糖蛋白表达的影响环孢素A作为MDRl基因mRNA上调和P.糖蛋白表达上调的阳性对照,不加药处理的Caco-2细胞作为阴性对照,采用RT--PCR技术分析阿立哌唑、喹硫平对Caco-2细胞MDRl基因mRNA水平表达的

4、影响。使用流式细胞术分析阿立哌唑、喹硫平对Caco.2细胞上P.糖蛋白表达的影响。2.P-糖蛋白对阿立哌唑、喹硫平的作用研究方法(1)测定阿立哌唑、喹硫平与P.糖蛋白的体外亲和力,为后续研究提供参考。采用磷钼蓝法测定0.01~100vmol/L不同浓度阿立哌唑或喹硫平与P.糖蛋白共孵育时,ATP酶的活性变化,用米氏方程计算亲和力参数vf。、K。、V一/K。,得到阿立哌唑、喹硫平与P.糖蛋白的体外亲和力。(2)P.糖蛋白功能对阿立哌唑、喹硫平转运的影响首先建立uplc—MS/MS同时测定阿立哌唑、喹硫平的方法,采用色谱柱

5、为AcquityUPLCTMBEHCl8柱(100mmx2.1mm,粒径1.719n),n博士学位论文中文摘要柱温40℃,流动相:乙腈--30mmol/L醋酸胺=63:37(V/V),流速:0.3m1.min-1,进样量41tl,质谱检测采用WatersMicromassQuattroPremierXE二极质谱仪,选用ESI+,检测模式为多反应监测模式(MRM)。样品氮气吹干再用1.氯代丁烷一三乙胺(5:0.5)进行提取。再研究阿立哌唑、喹硫平在transwell上的Caco-2细胞单层模型中的双向转运,考察时间、药物

6、浓度及P.糖蛋白抑制剂一维拉帕米对阿立哌唑、喹硫平转运的影响;用uplc.MS/MS测定阿立哌唑、喹硫平A到B侧和B到A侧的转运量,计算其表观渗透系数。三结果1.阿立哌唑、喹硫平对P_糖蛋白的作用研究结果(1)细胞培养及Caco-2单层细胞模型建立Caco-2细胞强表达P-糖蛋白,ECV304细胞弱表达P-糖蛋白;Caco-2单层细胞模型紧密且完整,细胞旁及跨细胞转运通路通透性良好。Caco.2细胞培养成功,Caco-2单层细胞模型成功建立,适合新型非典型抗精神病药与P.糖蛋白相互作用研究用;ECV304细胞适合作阴性

7、对照。(2)细胞毒性实验阿立哌唑、喹硫平为501unol/L时,细胞均未贴壁而死亡。小于等于30pmol/L时,细胞生长良好。阿立哌唑、喹硫平的最大无毒浓度为301xmol/L,适用于喹硫平和阿立哌唑对P一糖蛋白功能和表达影响的研究。(3)阿立哌唑、喹硫平对P.糖蛋白功能的影响当浓度为0.011unol/L时,喹硫平和维拉帕米组细胞内荧光强度与阴性m博士学位论文中文摘要对照组无显著性差异(P>0.05),而阿立哌唑组细胞内荧光强度显著高于阴性对照组(P<0.05),当浓度兰O.1pmol/L时,随着浓度的增加,阿立哌唑

8、、喹硫平和维拉帕米都使细胞内荧光增强,与阴性对照组间有显著性差异(P0.1pmol/L)时,喹硫平、阿立哌唑和维拉帕米对P—gP的功能均有抑制作用。(4)阿立哌唑、喹硫平对P.糖蛋白表达的影响在mRN

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