金黄色葡萄球菌SrtA的抑制剂发现与靶标验证

金黄色葡萄球菌SrtA的抑制剂发现与靶标验证

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时间:2019-05-15

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1、sortaseAByHongchuanLiuADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofMasterofPhamacologyShanghaiInstituteofMateriaMedicaMay,2013独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢

2、的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国科学院研究生院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名:日期:目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lAbstract...⋯...............................................................................⋯..........

3、........⋯.........⋯3第一章引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.5第一节金黄色葡萄球菌的表面蛋白与致病性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5第二节金黄色葡萄球菌的转肽酶SrtA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一91.1转肽酶SrtA的发现与功能研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.91.2转肽酶SrtA的结构与催化机制的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯111.3转肽酶SrtA的抑制剂研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13第三节立题依据和研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.16第二章实验材料和实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18第一节实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.181.1实验所用质粒和菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.181.2实验动物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.181.3实验所用试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.181.4实验所用仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.191.5实验所用试剂的配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.2

5、0第二节实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。232.1转肽酶Sa-SrtA与Sp.SrtA表达载体构建、蛋白表达和纯化⋯⋯⋯232.2转肽酶Sa-SrtA与Sp.SrtA的转肽活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262.3酶活水平的抑制剂筛选与ICS0测定:⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯262.4化合物SD3和SD9可逆性抑制的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯272.5反相HPLC实验检测化合物SD9对SrtA的抑制活性⋯⋯⋯⋯⋯..282.6基于SDS.PAGE的转肽实验检测化合物对Srt

6、A的抑制活性⋯⋯..282.7转肽酶SrtA的晶体培养、结构解析及其与SD9共结晶⋯⋯⋯⋯..292.8基于FITC.IgG的实验检测化合物对细胞壁SPA含量的影响⋯⋯..302.9WesternBlotting实验检测化合物SD9对细胞壁SPA含量的影响.312.10检测化合物对S.aureus与Fibrinogen包埋的板粘附的影响⋯⋯⋯332.11检测化合物对金黄色葡萄球菌生长的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯332.12MTT法检测化合物对SH.SY5Y细胞的毒性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯342.13化

7、合物的动物急性毒性试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35第三章实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36第一节转肽酶Sa.SrtA和Sp.SrtA的纯化与活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯361.1构建得到Sa.SrtA/pET28a和Sp.SrtA/pET28a表达载体⋯⋯⋯⋯⋯361.2纯化得到高纯度的转肽酶Sa.SrtA和Sp.SrtA⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯371.3转肽酶Sa.SrtA与Sp.SrtA活性测定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40第二节SrtA小分子抑制剂的筛选和构效

8、关系的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯..412.1转肽酶Sa.SrtA与Sp—SrtA的抑制剂筛选⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.412.2SD系列化合物的构效关系(SAR)分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯.432.3SD系列化合物对转肽酶Sa.SrtA抑制作用模式的研究⋯⋯⋯⋯..51第三节分子水平上对SD系列化合物的活性验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯523.1利用反相HPLC验证SD系列化合物对SrtA的抑制活性⋯⋯⋯..523.2利用转肽实验验证SD系列化合物对转肽酶SrtA的抑制活性⋯..533.3转肽酶SrtA的晶体培

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