根癌农杆菌介导的反义LEAFY基因导入悬铃木的遗传转化研究

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1、河南农业大学学位论文独戗眭声明、使用授权及知识产权虹屠承诺书学位论根癌农杆菌介姆的反义L队FY基因导学位文题耳入悬铃本的遗传转化研究级裂硕士学生学科导师姓名赵振利森林培育范国强专业姓名学位论文是否保密否如需保密，解密时间颦月日硗究生签名：，董i集张导搏签名：徽日期泌名月／o日日势k知—6=年‘月／·日学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农娥大学关乎保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学经论文豹霹剧本窝电予舨本；学校有权保存提交论文豹印刷本和电予版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩

2、印或扫描等复锲手段保存、汇缝学位论文。本人霹悫澎凑农业文学可以熙不嗣方式在不冠媒体上发袭、传播学位论文的全部成部分内容。本人完全了解《舅毒农烂大学知识产投傈护办法》鼢蠢关裁定，在毕效离开河南农业大学后，就在校期间从譬的科研工作发袭的所有论文，第一署名单蕴必湾嘉农业大学，试验耪辩，原始数据、孛援豹专穰等熟识产权均j基淫露农业大学所有，否则，承担相应的法律责任。洼；镙密擎麟文程舞密瑟逶藩予零芰捌蕊。研究生签磊I髦≥蒸酮导师签智i2囟萝毽学院领导缀名：，．日姚骆g月一日日辫S瓣多月协日IEI期：年月日致谢本论文是在导师范国强教

3、授悉心指导下完成的。从论文的选题、实验设计到论文的最后完成，都倾注了导师的大量心血。导师求实严谨的科学精神、勤奋认真地工作态度、精深博学的学识修养，引导我初探科学之曲径，培养我建立求真求实的态度，使我终身受益。三年来，导师在我学业上严格要求，生活上给予无微不至的关怀和照顾。值此论文完成之际，我谨向导师致以最诚挚的谢意。衷心感谢蒋建平、刘震、茹广欣、冯建灿、黎明、董慧英等诸位老师三年来对我的教诲。衷心感谢中心实验室的黄晓书、张慧琴，谢慧玲和周青云等诸位老师，在他们的热情帮助和指导下本实验才得以顺利完成。感谢崔红老师在实验过

4、程中给予的指导。感谢研究生处老师们对我的帮助和教导。衷心感谢在实验、学习和生活中给予我很多帮助的翟晓巧副研究员、张胜、曹艳春、史俊华，学弟胡文元、曾辉、祝宝玉、靳飞、刘国志、贾峰，学妹张变莉、魏真真。衷心感谢我在本科、研究生期间林学园艺学院的老师和各位同学。衷心感谢我的家人和朋友，他们的关心、支持、理解、鼓励、爱护和帮助是我战胜一切困难的精神支柱。．最后，再次深深地感谢所有关心、支持和帮助我的领导、老师、同学和朋友们!赵振利2006年6月于郑州根癌农杆菌介导的反义LEAFY基因导～悬铃木的遗传转化研究摘要悬铃木树干高大，

5、绿化效果好，叶片吸尘、杀菌，抗有毒气体和病虫害能力强，是世界著名的行道树，有“行道树之王”的美誉，因此，我国许多城市都有种植。但其果毛不仅污染环境，而且会引发呼吸系统及皮肤疾病，给居民的生活带来了极大的不便。为此，国内外学者曾进行了大量的研究工作，以期解决果毛污染问题。随着科学技术的发展，基因工程为解决这些问题提供了新的途径．本试验研究了影响根癌农杆菌转化悬铃木的多种因素，优化了转化条件，建立了悬铃木遗传转化系统；筛选出了适宜悬铃木组培苗叶片DNA的提取方法：利用GUS报告基因和PCR技术检测了外源基因在转化植株中的表达

6、，为遗传转化结果提供了分子生物学证据。实验结果如下：1．制备了转化悬铃木的工程农杆菌。表达载体pBll21中整合了反义LEAFY基因，在反义LEAFY基因上有一Hindlll酶切位点。通过碱裂解法提取质粒DNA，用Hindlll和EcoRI对其进行酶切，切出了预期大小的DNA片段。将此质粒用冻融法导入根癌农杆菌LBA4404。PCR扩增显示反义LEAFY基因转入农杆菌中。2．Ka和Cef等抗生素对悬铃木外植体再生的影响存在一定的差异。在幼芽生根和叶片分化培养基中分别加入质量浓度为15mg·L-l和40mg·L．1Ka，根

7、和叶片愈伤组织、幼芽的诱导率均为O；在分化和生根培养基中分别加入质量浓度为500mg·L．1和800mg·L-l的Cef则可使愈伤组织、幼芽和根的诱导率为0。在叶片分化培养基中同时加入这2种抗生素，愈伤组织和幼芽诱导率为0的Ka+Cef组合的质量浓度为30mg·L-1+400mg·L．1。3．优化了根癌农杆菌介导悬铃木的遗传转化体系。预培养9d的悬铃木叶片在OD600值为0．7的根癌农杆菌菌液中浸染10rain后，再在含有100pmol·L．1的乙酰丁香酮的共培养培养基上黑暗条件下共培养3d叶片的遗传转化效率最高。该体系

8、的建立为进行农杆菌介导外源目的基因培养悬铃木新品种奠定了基础。4．筛选出了悬铃木遗传转化过程中抑制愈伤组织褐化的物质及其质量浓度。在D11、PVP和AC3种物质中以0．08mg·L．1的DTl’抑制褐化最有效，褐化率为1904：质量分数为O．1％的AC次之，褐化率为27％；质量浓度为2000mg·L4的PVP褐化率最