聚合酶链反应（PCR）检测鸭瘟病毒方法的建立及鸭瘟弱毒CHa株在雏鸭体内分布规律的研究

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1、学位论文声明本人郑重声明：所呈交的论文是在I四Jil农业大学完成的硕士学位论文，该论文的知识产权属于四川农业大学，论文的的发表权和署名权属于四川农业大学。本人完全清楚和意识到本声明的法律后果由本人承担。储签名励舯钿／日摘要本文根据基因库(GeneBank)登载的鸭瘟病毒(DuckPlagueVirus，DPV＆DuckEnteritisVirus，DEV)基因组中的一个765bp长的艮DRI片段(AnatidHerpesvirus1DNAPolymeraseGene＆UnknownGene)，运用软件OLIGO设计～对引物，其扩增幅度为498bp。应用这对引

2、物针对鸭瘟病毒(DPV)DNA进行扩增，获得了与设计大小相符合的特异性条带，成功建立了检测鸭瘟病毒的PCR方法。确立了PCR的最佳反应条件，引物浓度为0．5川d，Mg”作用浓度为2．5pM；最佳反应模式为：95"(2变性5min，进入94℃imin，51．8℃imin，72℃2min的循环，共进行35个循环，最后经72℃延伸lOmin后于4℃结束反应。特异性试验表明，对七种对照禽病病原体(鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭巴氏杆菌、鸭大肠杆菌、鸭副伤寒沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌)的基因却扩增不出任何条带，为阴性。敏感性试验表明，可检测

3、到lOfg的鸭瘟病毒DNA模板。本文研究了鸭瘟病毒弱毒Cha株经皮下、口服和滴鼻三种途径接种含母源抗体的雏鸭后，应用本文建立的PCR方法检测不同时间鸭瘟弱毒在鸭体各组织器官的分布规律。分别在接种后的第4h、8h、12h、24h、3d、5d、7d、lOd、14d、17d和21d人工致死雏鸭，收集雏鸭的静脉血液、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、直肠、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌头、肌肉、骨髓、粪便和食道共19种样品进行PCR检测。试验结果表明：①皮下组在接种后的第4h，即可在心、肝、脾、肾、法氏囊、胸腺、胰腺、延脑、大脑和小脑共lO种组织中检出DPV的

4、DNA，8h后所有采取的组织器官均可检测到DPV的DNA：②口服组最早在接种后4h可在舌头和食道中检测到DPV的DNA，8h后可在心、肝、脾、肾、胸腺、胰腺、延脑、大脑、小脑、舌头、食道和血液共12组织器官中检出DPV的DNA：③滴鼻组在接种后4h未能在组织中检出DPV的DNA，8h后可在心、肝、脾、肾、胸腺、延脑、大脑、小脑、舌头、食道和血液共11中组织中检测到DPV的DNA。④在三种途径中，检出时间最早和检出率最高的组织器官为肝脏、脑(大脑、小脑和延脑)，至第21天时均能稳定、持续地从所采取的组织中检测出DPV基因组。本研究建立的PCR方法适合于作为鸭瘟

5、病毒感染的实验室诊断：应用本研究建立的PCR诊断方法检测鸭瘟病毒弱毒株在雏鸭体内的分布规律，从而为临床上更好地应用鸭瘟病毒弱毒株预防鸭瘟提供了有力的理论依据。关键词：聚合酶链反应诊断方法鸭瘟弱毒株分布规律前言鸭瘟(DuckPlague，OP)，又名鸭病毒性肠炎(DuckViralEnteritis，DVE)，是鸭、鹅和天鹅的一种急性败血性传染病，其特征为体温升高，两腿麻痹、下痢、流泪和部分病鸭头颈肿大。该病为一种广泛嗜全身性感染的传染病，临床以急性败血症过程为特征。其特征是血管损伤，体腔出血，消化道出血、炎症和坏死，淋巴器官受损以及实质器官的退行性变化。发病

6、率和死亡率都甚高，是养鸭业的一大危害[卜⋯。1923年，BaudetLSJ报道荷兰的家鸭暴发了一种急性出血性疾病。细菌培养阴性，家鸭接种无菌过滤的肝悬液后复制出该病。之后，在荷兰又有更多的病例报道。DeZeeuw。。证实了Baudet的发现并再次指出病毒对鸭的专一性，但他认为该病毒是适应了鸭的鸡瘟病毒。1942年，Bos⋯对前人的工作进行了重新审查，并观察了新暴发的疾病。对鸭的病变特征、临诊病程、免疫反应进行了深入的研究，他认为该病不是由鸡瘟病毒引起的，而是鸭的一种新的病毒性疾病，并提议称其为“鸭瘟(DP)”。1949年，Jansen和Kunst在第十四届国

7、际兽医学会上建议采用鸭瘟为法定名称。这主要是根据在自然和人工感染中该病原对鸭具有高度的特异性。在荷兰，该病表现一直很一致，而潜伏期较长。他将该病与新城疫区别开来。随后关于病毒增殖、发病率和分布，病理学和免疫力的深入研究也进一步支持了这一观点“。。随后，本病相继发现于法国(1949)、美国(1950)、印度(1963)、比利时(1964)、英国(1972)、泰国(1976)和加拿大(1976)，其流行范围逐步扩展开来。1967年，美洲大陆报道了鸭瘟病毒在长岛的规模化北京鸭养殖区暴发，此外在长岛的7个不同地方，野生、自由飞翔的水禽亦曾暴发鸭瘟”。。美国人根据本病

8、的病理变化特征，称之为鸭病毒性肠炎(DuckVira