表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

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1、中国试剂网3.9.101表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，3

2、7OC溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。2、1.5MTris-HCl(pH8.0)：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。3、1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4、10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶,浓盐酸调至pH7.2,定容至100ml。5、10×电泳缓冲液(pH8.3)：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。

3、6、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。7、2×SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%)的配制:ddH2O4.0ml中国试剂网3.9.

4、10130%储备胶3.3ml1.5MTris-HCl2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μl封底,余加TEMED4μl,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需30-60min）2、积层胶（4%）的配制：ddH2O1.4ml30%储备胶0.33ml1MTris-HCl0.25ml10%SDS0.02ml10%AP0.02mlTEMED2μl将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需

5、15-30min。（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。（三）上样:取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。（三）电泳:在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室

6、温4-6hr。（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事项中国试剂网3.9.1011、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。