植物组织培养5

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1、第五章.花药及花粉培养一.花药培养二.花粉及小孢子培养一、花药培养1．概念花药培养(antherculture):把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.Tobaccoantherwithdevelopinghaploidplantlet,arisingfromthemicrospore2、花药培养的基本程序是：外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养-移栽（1）外植体的选择基因型的选择通过花药培养成功获得单倍体植株最多的是茄科植物，其次是十字花科、禾本科、百合科等植物。同一植

2、物的不同类型、不同品种对花药培养的反应也是不同的。因此在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培养成功的材料来做。供试材料的生理状态在多年生植物中，幼年植株比老龄植株的花药诱导频率高。草本植物生长健壮、且处于生殖生长高峰期的花药诱导频率高，徒长或营养不足的植株花药培养的诱导频率低。花粉的发育时期四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉最适期涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药为好。在花药培养中，如果每次取材时都要进行花药发育时期观察是很不方便的，一般是在试验之前，对花药

3、的发育时期和其相对直观的生长发育特点进行相关研究，通过直观的对应性状来确定花粉的发育时期，如花粉发育时期与花药大小、花蕾大小、花冠展开程度、旗叶与倒二叶之间的距离等的关系，然后根据这些直观特征判断花粉发育时期，取材。例如：柑橘在花冠露白时大多数花药处于单核晚期马铃薯在花冠漏出萼片一半时大多数处于单核晚期烟草则在花冠漏出1/3-1/2，花冠和花萼等长时为花药培养的最佳时间。小麦：幼穗中部在倒二叶的叶耳的上下1厘米之间。a、醋酸洋红法将花药放在载玻片上，加一滴1%的醋酸洋红（于100ml煮沸的45%醋酸中缓慢加入1g洋红，回流煮沸8h于50℃下过滤

4、即得），用镊子把花药捣碎，加盖玻片后在显微镜下检查。茄科、禾本科的大多数植物的花药均可用此法，但水稻、番茄、芸苔属和许多木本植物的花药细胞核不易着色，可采用桔花青-铬矾法b、桔花青-铬矾法将花药先在卡诺固定液固定20min，然后取出放载玻片上，加桔花青-铬矾染色液制片和镜检。细胞核染成黑色。桔花青-铬矾染色液的配方：将5g铬明矾（K2SO4.Cr2（SO4）3.24H2O）加入100ml蒸馏水中后加1g桔花青混匀，加温至沸腾，并煮沸5min，冷却至室温过滤，并加蒸馏水至100ml。(2)花药预处理为了提高花药培养的成功率，需要在接种前对实验材料进行各

5、种预处理，已经证明有效的预处理方法有：A低温预处理低温预处理可以明显提高花粉胚的诱导效率。但各种植物要求的温度和处理时间有差异：烟草7～9℃7-14天水稻10℃10～14天柑橘3℃5～10天马铃薯4℃2天低温预处理的作用机理，学者们提出以下几点：1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退

6、化，从而切断与小孢子之间的联系。4)无论哪种机理正确，但结果是预处理能促进花粉启动，提高诱导率和再生率。B热处理在一些物种中（芸苔属），将花芽或完整植株在30℃下处理24h或40℃下处理1h，能够刺激花粉的胚胎发生。或者接种以后将其放在高温下处理3-8天，可以显著提高花粉植株诱导率。已在小麦，甜椒中得到应用。C、离心预处理Tanaka将单核后期的烟草花药在10000-11000r/min的速度下离心30min，产生小植株的频率从30.5%提高到38.2%D、乙烯利预处理培养基中较低浓度的乙烯利（40mg/L）对花粉愈伤组织的形成有明显的促进作用。可能

7、原因促使花粉的分裂。E甘露醇预处理将花药在0.3mol/L甘露醇溶液预培养3-5d，可以提高花粉胚的诱导率。重蒸水表现出与甘露醇相似的结果。这可能是由于这种处理方式使小孢子处于碳饥饿状态，导致花粉从正常发育途径转向雄核发育途径。(3)外植体的消毒挑出适宜培养的花蕾或幼穗，一般先将花蕾或幼穗的表面用70%乙醇浸泡1min，然后在0.1%升汞中浸泡3-5min，用无菌水冲洗3-5次。如果花蕾包裹严密，内部一般是无菌的，比如小麦，只需用沾有70%酒精的纱布对叶鞘进行表面擦拭就可达到灭菌的目的。（4）接种将消毒过的材料置于超净工作台上，无菌剥取花药进行接种

8、，在剥取花药时，应注意在整个操作过程中尽可能避免花药受到损伤，否则常常会刺激花药壁形成愈伤组织，如果是花药较