可示踪的复制型hbv载体的构建及其生物学特性研究

可示踪的复制型hbv载体的构建及其生物学特性研究

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1、授予单位代码10089学号或申请号20102242硕士学位论文科学学位可示踪的复制型HBV载体的构建及其生物学特性研究作者姓名平采艳导师孙殿兴教授专业内科学二级学院白求恩国际和平医院研究起止日期2011年2月—2013年3月交稿日期2013年3月万方数据目录中文摘要.....................................................1英文摘要.....................................................5英文缩写..........................................

2、..........10研究论文可示踪的复制型HBV载体构建及其生物学特性研究前言...................................................12材料与方法.............................................13结果...................................................32附图...................................................36讨论.................................

3、..................49结论...................................................51参考文献...............................................51综述报告基因研究进展及其在基因表达中应用..................54致谢........................................................71个人简历....................................................72万方数据中

4、文摘要可示踪的复制型HBV载体的构建及其生物学特性研究摘要乙型病毒性肝炎是一个全球性的健康问题,在全世界有超过3.5亿乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染者。迄今在乙型病毒性肝炎防治领域仍存在许多重大的、尚待解决的科学问题,如对HBV生活周期和复制过程的了解仍有限;HBV侵袭肝细胞的分子机制;慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝癌的发病机制仍未完全阐明。HBV感染与复制模型是研究HBV生物学特性、探索抗HBV药物的新靶点、抗HBV药物耐药性的研究以及筛选新的抗病毒药物、评价新的免疫疗法和疫苗必不可少的重要工具。许多病毒通过插入外源基因,构建了复制型病毒载体,并

5、且在分子生物学研究中发挥了重要的作用。如果把HBV改造为可示踪的复制型病毒载体,将可以大大提高新型抗HBV药物的研发效率,并有助于阐明HBV研究领域中许多尚待解决的科学问题。鉴于上述挑战,本课题利用本实验室前期构建的复制型HBV载体,结合荧光分子及荧光素酶报告基因最新进展,构建分别表达小分子荧光基TM团(miniSOG)、标准型Nanoluc荧光素酶(NanolucLuciferase,Nluc)和分TM泌型Nanoluc荧光素酶(SecretoryNanolucLuciferaseSecNluc)三种报告基因的复制型HBV载体,检测重组HBV生物学特性及其,感染能力。目的:

6、利用miniSOG、Nluc、secNluc的报告特性,形成可示踪的,复制型重组HBV载体并检测其生物学特性及其感染能力。方法:1PCR方法获得miniSOG、Nluc、secNluc全长序列。2利用基因重组技术,将所获得的miniSOG、Nluc、secNluc序列,亚克隆至本实验室先前构建的复制型载体pCH-rep中,构建如下3个质粒:pCH-miniSOG、pCH-Nluc、pCH-secNluc。以我实验室先前构建的带有四环素调控元件和潮霉素抗性基因的野生型pTRE-HBV-C7-5为母体质粒,将HBV部分替换为上述表达报告基因的HBV-miniSOG、HBV-sec

7、Nluc,1万方数据中文摘要获得pTRE-HBV-miniSOG、pTRE-HBV-secNluc载体。3pCH-miniSOG分别瞬时转染HepG2、293、Huh7细胞系,以本实验室先前构建的HBV复制型载体pCH-hrGFP为对照,荧光显微镜下观察转染后72小时细胞内荧光强度。4质粒pCH-3093、pCH-Nluc、pCH-secNluc、pCH-miniSOG及携带杀稻瘟菌素抗性基因(BlasticidinRegene,BsdR)和人源绿色荧光蛋白(HumanizedGreenFluoresc

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