非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

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1、分类号学号ＭＺ１２５０３ＵＤＣ密级緩？义聲叫ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩＪ硕击学佐冷文业型（专）非洲猪瘍病毒胶体金免疫层析试纸条的研制吴海涛＇大学江苏扬州，２２５００９指导教师姓名：成大荣教授，损州，？硕去学科专业名称巧请举仿级别：；兽医硕去论文提交日期：２０１５年４月论文答辩日期：２０１５年６月学位授予单位：扬州大学学位授予日期：２０１５年６月答辩委员会主席：郭爱珍教授２０１５年６月非洲猪痘病毒胶体金免疫层析试纸条的研制Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏ

2、ｆｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｒｉｐｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｍｓ研究生；吴海涛导师；成大荣教授专业；兽医硕±ＹａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＪｕｎｅ２０１５吴海涛：非洲猪遍病毒胶体金免疫层析试纸条的研制１＿中文摘要非洲猪摇（Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ，ＡＳＦ）是由非洲猪痘病毒（Ａｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，一ＡＳＦＶ）引起的猪的种急性、烈性、高度接触性传染性疾病。其临床特征主要

3、为全身出血、呼吸障碍巧神经症状，发病率和死亡率高，对养猪业的危害巨大。且目前尚无有效的疫苗用于该病的预防，主要通过检疫后扑杀来控制其爆发和流行。因此，建立科学有效的检测诊断方法对于非洲猪癌的防范具有重要意义。为获得ＡＳＦＶＰ７２融合蛋白ＥＴ－３０ａ－７２，本研究利用前期研充中构建的重组菌株ｐＰ＞（ＢＬ２１）接种到ＬＢ液体培养基，ＷＩＰＴＧ进行诱导后，收集菌体并レッ超声波进行裂解，裂－证明了该Ｐ７２融合蛋白可Ｗ在大肠杆菌ＢＬ２解物经ＳＤＳＰＡＧＥ分析，１中大量表达。通过免疫印记技术分析可知，该融合蛋白可Ｗ与鼠抗Ｈｉｓ

4、标签单抗特异性反应，将表达的Ｐ７２重组蛋白经Ｈｉｓ标签蛋白纯化试剂盒纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。复苏本实验室保存的抗ＡＳＦＶ的杂交瘤细胞株２Ｄ３，扩大培养后接种于１０周龄Ｗ上经产ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，采用体内腹水诱生法制备了含有抗ＡＳＦＶ单抗的腹水。Ｖ抗体分别经饱和一将收集的ＡＳＦ硫酸钱法、辛酸硫酸较联合沉淀法、ｐｒｏｔｅ虹Ｇ柱－亲和层析法进行纯化，对纯化后的抗体经ＳＤＳＰＡＧＥ比较分析，最终选择纯化效果较好的ｐｒｏｔｅｉｎＧ柱亲和层析法。纯化后的抗体经紫外分光光度仪测定浓度，并用已建立的间接ＥＬＩＳＡ法测定其

5、效价，单抗为１：１６００００，多抗为１：５１２００。为制备ＡＳＦＶ胶体金免疫层析试纸条，研究中采用直径为３０ｎｍ的胶体金颗粒标记纯化后的单抗２Ｄ３作为金标抗体，Ｗ纯化后的多抗固定于ＮＣ膜上作为检测线，其最佳．４７ｍ／ｍ＾将葡萄球菌Ａ蛋白（ＳＰＡ）固定于ＮＣ膜上作为质控线浓度为１ｇ，其最佳浓度为ｍＬ。－１．０ｍｇ／，组装成用于检测ＡＳＦＶ的胶体金免疫层析试纸条ｐＥＴ３０ａ和－ＰＧＥＸ－６Ｐ１为载体表达的ＡＳＦＶＰ７２蛋白（简称Ｐ３Ｐ蛋白和ＰＸＰ蛋白）作为阳性样晶，ＰＢＳ缓冲液、生理盐水、蒸馈水等作为阴性样品来检测试纸

6、条。结果显示阳性样品有明显的两个条带一且试纸条能检测到的Ｐ，而阴性样品只显示个条带，３Ｐ蛋白和ＰＸＰ蛋白的最低浓度分别为４５ｉｉ／ｎｉＬ和６０ｎ／ｍＬ。ｇｇ关键词：非洲猪痘病毒；免疫；；抗体；免疫金层析试纸条２扬州大学硕±学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒＡＳＦｉｓａｎａｃｕｔｅｖｉｒｕｌｅｎｔｈｉｈｌｃｏｎｔａｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｏｆｄｏｍｅｓｔｉｃｉｓ（），，ｇｙｇｐｇｃａｕｓｅｄｂＡｆｒｉｃａｎｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒａｓＡＳＦＶ．Ｔｈｅｍａｉｎ

7、ｃｌｉｎｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｓｏｆＡＳＦｉｎｃｌｕｄｅｙ（）ｓｙｓｔｅｍｉｃｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ，ＫＳｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｏｒｄ郑ｓ，ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅｒａｔｅａｎｄｄｅａｔｈｒａｔｅ．ＡＳＦｉｓｓｅｒｉｏｕｓｌｙｔｈｒｅａｔｅｎｉ凸ｇ化ｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｉｇｗｉｔｈｎｏｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄＳｏｉｔｉｓｖｅｒｉｍｏｒｔａｎ化ｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｅｆｅｃｔｉｖｅｔ

8、ｅｃｈｎｏｌｏ１：０ｄｅｔｅｃｔｔｈｉｓｄｉｓｅａｓｅ．．ｔｙｐｇｙ＊Ｉｎ－－ｔｈｉｓｉｅｓｅａｒｃｈｉｒｅｃｏｍｂｉ