重组鸡白细胞介素2质粒（pCIChIL2）作为免疫佐剂的研究

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1、浙江大学硬士学位论文摘要自细胞介素2(interleukin-2，IL2)是由抗原刺激T淋巴细胞产生的细胞因子。该细胞因子是重要的免疫调节分子，能促进T细胞增殖、B细胞分化及分泌抗体，能增强单核细胞及NK细胞的杀伤活性。国内外有学者报道共注射IL-2和疫苗，可以提高机体的体液和细胞免疫。直到1979年，鸡II．，2(ChIL-2)才首次被克隆成功，随后体内外实验证实ChlL-2与哺乳动物IL．2有相似的免疫功能。本论文围绕pCI—ChlL-2质粒作为新型免疫佐剂的安全性和临床应用开展了系统研究。取得的研究结果如下：本研究室成功克隆C

2、hlL-2基因，并保存在pGEM-T-Easy载体中，利用PCR将ChlL．2基因亚克隆入pCI真核表达载体中，上下游引物分别引入踟RJ和SalI酶切位点，其中下游引物还缺失了终止密码子。利用EcoRI和SalI对pEGFP-NI载体进行双酶切，从而获得EGFP基因。然后将EGFP连入pCI-ChlL-2，构建pCI．．ChlL．2-EGFP质粒，该质粒可以表达融合蛋白chIL2一EGFP。质粒pCI．ChlL-2-EGFP体外转染Vero细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)、外周血单核细胞(eBMC)，荧光显微镜下观察融合蛋白的表达情况

3、。结果表明，转染后8h即可观察到荧光，36h达到高峰，此时细胞的转染效率分别为70％、50％和80％左右。转染pcI空质粒的细胞未见到任何荧光。pCI-ChlL．2-EGFP通过腿部肌肉接种14目龄非免疫鸡，通过RT-PCR、ELlSA和荧光显微镜检测ChlL-2．EGFP在体内的表达情况。接种后8h～14d肌肉接种部位均有融合蛋白的表达，接种后5d达到高峰，此时被转染的肌细胞占接种部位肌细胞的5％左右。这些结果说明pCI-ChIL一2一EGFP质粒在体内外均可持续较长时间的表达。质粒pCI．ChlL．2通过腿部肌肉接种14日龄非免

4、疫鸡，通过竞争PCR和特异性PCR检测重组质粒在血清、心脏、肝脏、肺脏、脾脏、法氏囊和局部组织的分布情况。结果表明：接种后2小时血清中即可检测到pCl．ChlL-2，8小时达到高峰，7天时己检测不到；loCI．ChlL-2在其余几种组织器官中存在的时间比较长，1～14天各组织器官中均有分布，接种后32天仅有局部组织可以检测到重组质粒。质粒pCI．ChlL-2与H5亚型禽流感油乳赉j灭活苗联合应用，观察pCI-Chll_,-2对AIV疫苗的免疫增强效果，原核表达蛋白rChlL．2与AIV疫苗联合应用作为对照。MTT法检测各组鸡外周血淋

5、巴T细胞增殖，m试验监测H5亚型禽流感抗体水平的消长规律，结果表明：pCI-ChlL-2及rCIdL-2均能显著增强AIV疫苗的免疫效果(P0．05)；证实pCl。ChlL．2质重组鸡白细胞介秉2质粒(pcI-ChlL-2)作为免疫佐剂的研究浙江大学硕士学位论文粒和rChIL-2蛋白均对H5亚型禽流感疫苗有免疫增强作用。rChIL-2协同免疫组MTr及m试验均在第4周达到峰值，pCl．ChIL-2协同免疫组峰值出现时间稍晚，但随后质粒免疫组可维持在更高的水平

6、值。这表明pa．ChIL-2在体内持续的时间更长。根据农业部的批复，对含鸡白细胞介素2基因的pcI质粒作为免疫增强剂在浙江省进行了中间试验、环境释放试验和生产性试验。检测重组质粒在注射局部的残留时间及在各脏器和血清中的分布；监测重组质粒在动物粪便及环境微生物中的存活情况及环境微生物中氨苄青霉素的抗性发生情况{检测该质粒对商品化疫苗的免疫增强效果并观察试验鸡的临床表现情况。结果表明。重组质粒在多种组织器官中可以残留较长时间，所有试验鸡场环境微生物监测不存在pCHL．2抗性基NAmp的转移情况，对环境是安全的。该质粒可明显提高禽流感、新

7、城疫、传染性法氏囊病等商品化疫苗的免疫效果且所有试验鸡无任何不良反应，对鸡是安全的。总之，编码ChIL-2的真核表达质粒通过肌肉接种后。可以广泛地分布于机体多种组织器官中，持续长时间表达。研究证实pCI．ChIL-2可以有效地提高禽类疫苗的免疫效果。为重组鸡白细胞介素2质粒作为免疫佐剂在临床上的应用提供依据。关键词：白细胞介素2(interleukin-2，m-2)，鸡IL-2(ChlL-2)，分布，表达，免疫佐剂重组鸡白细胞介素2质粒(pCI--ChlL-2)作为免疫佐剂的研究2浙江大学硕士学位论文Abstracthterleuk

8、in-2(IL-2)isalymphokineproducedbyTlymphocytesfollowingantigenstimulation．Thislymphocyteisrecognizedasallimportantimmt