蛋白酶体抑制剂硼替佐米逆转白血病多药耐药机制的实验研究

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1、·英文缩略语·中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：睦墨雪日期：塑丛：￡兰L中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解

2、中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日·中文论著摘要·蛋白酶体抑制剂硼替佐米逆转白血病多药耐药机制的实验研究目的白血

3、病细胞多药耐药(MDR)是化疗失败及缓解后复发的主要原因之一，克服多药耐药(徊R)是提高白血病疗效的重要途径。多药耐药性(multidmgresistance，MDR)是指肿瘤细胞接触了一种药物以后，不但对该药产生耐药性，而且对其它结构和作用机制不同的药物也产生耐药性。它是由多种因素共同引起的一个复杂过程，目前认为由mdrl基因编码的P．糖蛋白(P．go)过表达造成抗癌药物外排增加、药效降低，是耐药形成的主要原因。最新的研究结果显示NF．KB通过引起mdrl基因表达增加调节P—gp介导细胞多药耐

4、药。抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时也激活NF．KB，NF．KB进入细胞核内与一B位点结合，诱导NF．一B调控mdrl基因表达。蛋白酶体抑制剂硼替佐米通过阻止蛋白酶体降解I出(NF．出的负性调节器)，能显著地抑制NF．出的活化，下调mdrl基因表达水平，刺激肿瘤细胞凋亡。从而增强治疗效果和逆转耐药性。最近的临床前研究发现在一系列血液和实体恶性肿瘤体内和体外模型中蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以减少细胞增殖，诱导细胞凋亡，增强化疗和放疗的疗效，并且逆转化学药物耐药性。但目前关于硼替佐米的研究中所采用的肿瘤

5、细胞系多为化疗敏感株，而对肿瘤多药耐药细胞株研究很少。本实验采用表达mdrl．mRNA的白血病多药耐药细胞株，观察硼替佐米作用前后白血病多药耐药细胞的mdrl—mRNA及其编码的P-gp变化及细胞周期和凋亡的变化，进一步探讨mdrl-mRNA及其编码的P·gP变化与细胞凋亡情况之间的关系。旨在进一步明确硼替佐米逆转白血病细胞MDR的分子机制。实验材料1、K562／S和K562／DNR细胞株2、蛋白酶体抑制剂硼替佐米和柔红霉素3、MTT法检测细胞耐药性相关试剂4、荧光定量PCR法检测肿瘤多药耐药基

6、因(mdrl)试剂盒5、流式细胞仪检测P-gp水平的相关试剂6、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的相关试剂实验方法1、细胞培养K562／S和表达多药耐药基因mdrl的人K562／DNR细胞均培养于含100U／ml青霉素、100ug／ml链霉素和12％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，培养条件为37"c，饱和湿度，5％C02／95％空气。2、K562／DNR细胞耐药性检测接种对数生长期K562／S，K562／DNR细胞于96孔板，培养12h后，加入DNR继续培养68h后，加入20ulMTT继续

7、培养4h，2000r／min离心10min，弃上清，每孔加150ulDMSO，酶标仪测定540nm吸光度，完全培养基作为空白对照，每个浓度重复6个孔。3、细胞内药物浓度测定指数生长期K562／S、K562／DNR细胞悬液用预冷的PBS洗涤3次后，用含12％胎牛血清的RPMll640培养液配制成1X106／mE细胞悬液，分别加或不加硼替佐米(终浓度10nmol／L)，再加DNR工作液，使DNR终浓度为5umol／L，37。C孵育90min，离心弃上清，用预冷的PBS洗涤2次，加入新鲜培养液，流式细

8、胞仪测定细胞内DNR荧光强度。4、荧光定量PCR检钡JJmdrl．mRNA表达分别收集经0nmol／L、5nmol／L、10nmol／L、50nmol／L、100nmol／L硼替佐米处理24h的细胞，采用Trizol提取总RNA，按试剂盒说明书进行逆转录合成eDNA，PCR扩增，反应结束后，由计算机自动分析出定量结果。5、细胞中P．gP的检测2分别收集经0nmol／L、5nmol／L、10nmol／L、50nmol／L、lOOnmol／L硼替佐米处理24h的细胞，加入Anti-p-glycopr