生物工程下游技术第十四章+电泳分离技术

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1、第十四章电泳分离技术前言1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔奖。70年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短电泳时间。3、扩大应用范围。各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。1.电泳技术的基本原理u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分)V:泳动速度:cm/秒or分E:电场强度:伏特/cmd:泳动距离:cmt:电泳

2、时间:秒/分U:电压:常压(100—500v)高压(500—10000v)仅需几分钟l:支持场的长度(有效长度)(1)泳动度u(迁移率):带电质点在单位强度电场下的泳动速度不同分子在同一电场中可能具有不同的泳动度(2)影响泳动率u的因素内因：1.净电荷2.质点大小3.质点形状外因：1.V(U/L)2.缓冲液的pH(pH恒定)3.离子强度[I]最适:0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动(3)电泳类型a.载体电泳纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、

3、等电聚焦、梯度、免疫电泳b.自由界面电泳支持物为溶液，很少用。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP)或核黄素(C17H2O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。■凝胶的聚合反应：Ammoniumpersulfate(freeradicalinitiator)过硫酸铵Acrylamide(monomer)Bis(acrylamide)(bridge)TEMED(catalyst)

4、:四甲基乙二胺自由基的生成者凝胶的基本單位:丙烯酰胺交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺帮助传递自由基的加速剂Acrylamide有毒性！-(OS-SO)442-2SO4CH2=CH-CO-NH212112核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统■丙烯酰胺单体聚合过程：聚合反应交联剂造成分枝端点自由基可再延续freeradicalBisBis聚合反应交錯连結自由基形成光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。化学聚合：制小孔胶。过硫酸铵(NH4)2S2O3APS(引发剂)N,N,N,N’-四甲基乙二胺，TEMED(加速剂)2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳原理三种物理效应⑴样品

5、浓缩效应⑵分子筛效应⑶电荷效应三种物理效率使样品分离效果好，分辨率高（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。①凝胶孔径不连续性②缓冲液离子成份的不连续性③pH的不连续性①凝胶孔径不连续性单体浓度交联度大孔胶:T=3%C=2.0%小孔胶:T=7%C=2.5%凝胶网孔大小:聚合链长度:由Acr浓度交联程度:由Acr与Bis相对比例Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。分子量范围适用的凝胶浓度/(%)蛋白质<10420-301

6、-4×10415-201-5×104-1×10510-151×1055-10>5×1052-5核酸(RNA)<10415–20104–1055-10105-2×1062-2.6②缓冲液离子成份的不连续性大孔胶pH=6.7先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何pH值下随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中pI=6.0pKα1=2.34pKα2=9.70在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-。Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在③pH的不连续性pH大孔(浓缩)胶6.7小孔(分离)胶8.9缓冲液8.3A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子、慢离子B显示电泳

7、开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。电泳过程示意图不连续系统浓缩效应示意图连续胶与不连续胶:连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条浓缩胶分离胶不连续胶的制胶过程与点样过程玻璃板(前,后)样本梳间隔条间隔条■电泳凝胶系统的组成：1电泳系統pH胶体浓度缓冲液上层(负极)缓冲液2样品溶液3浓缩胶6.94分离胶胶体5下层(正极)缓