专题22土壤中分解尿素的细菌的分离与计数安中

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1、安县中学一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)脲酶+CO2NH3+H2O3、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照（一）筛选菌株水生耐热

2、细菌Taq(Thermusaquaticus)耐高温的TaqDNA聚合酶美国微生物学科布鲁克（T.Brock)1966年发现耐热细菌筛选菌株1.自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。2.实验室筛选：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2

3、.1gNaH2PO41.4gKH2PO4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。培养基选择分解尿素的微生物的原理测定微生物数量的方法：1、直接计数法：最常用的显微镜直接计数。先将待测样品制成悬液，然后取一定量的悬液放在

4、显微镜下进行计数（血球计数板）。根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数。优点：设备简单、能观察微生物的形态特征。缺点：不能区分死菌和活菌；不适于运动的细菌计数难以计数微小的细菌。应用：一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。（二）统计菌落数目2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的

5、平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平

6、板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。（三）设置对照1、对照实验：指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验，作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试条件引起的相应结果。2、对照实验的目的：排除实验组中非

7、测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。（小结）操作：设置重复组，增强实验的说服力和准确性。

8、将待测样品经过一系列的稀释，然后选择三个稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养。（注意）：为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂布到3个或3个以上的平板上，经培养，计算出菌落的平均数。对照原则：判断培养基中是否有杂菌污染，将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用，对照培养基接种后培养观察菌落数目。计算公式：每克样品中的菌株数=（C/V）*M（1）原理：尿素是一种重