专题三土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、课题背景1、尿素的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌能利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH33、常见的分解尿素的微生物芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。4、课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照1、实例：PCR技术启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的

2、要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。㈠.筛选菌株要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：⑴抑制大多数微生物的生长⑵促进目的菌株的生长结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。15.0g琼脂1.0g尿素10.

3、0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。5、培养基选择分解尿素的微生物的原理在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。6、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿

4、素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种目的结果只生长尿素细菌生长多种微生物是1、显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释

5、度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。？说明设置重复组的重要性。在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。旁栏思考题1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或

6、三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④在计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定点的记录作为结果，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。计算公式：每克样品中的菌株数=（C÷V）×M某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B例题：统计菌落数目的方法有（）A.①②③⑥B.③④⑤⑥C.②③④⑥D.①③④⑥D①涂布平板法②重量法③直接计数法④比浊法⑤生理指标法⑥膜过滤法（三

7、）设置对照判断培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含