[医学]酶免疫技术

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1、酶免疫技术及室内质量控制EnzymeImmunoassayandqualitycontrol叶芸免疫标记技术是用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定敏感性、特异性、精确性及应用范围免疫荧光技术放射免疫技术免疫酶技术免疫电镜技术免疫胶体金技术发光免疫测定抗原抗体反应＋酶催化反应肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计特异、敏感可以在细胞或亚细胞水平上示

2、踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。酶免疫技术EnzymeImmunoassay（EIA）一、概述酶免疫标记用于抗原检测（一）基本原理酶标记抗体或抗原：抗体或抗原的免疫学反应特异性＋酶活性酶是一种有机催化剂：使底物基质水解而呈色使供氢体由无色还原型变为有色氧化型∴可用呈色反应显示酶的存在。很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。（二）常用的酶及其底物酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与

3、抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。常用酶底物显色辣根过氧化物酶邻苯二胺、H2O2橙黄色四甲基联苯胺、H2O2蓝色碱性磷酸酶对硝基本磷酸脂黄色（三）标记方法酶结合物技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。（四）酶标记物的纯化及鉴定1、纯化葡聚糖凝胶层析法50%饱和硫酸铵沉淀提纯法2、鉴定免疫活性鉴定：免疫电泳/ELISA（五）固相酶免疫测定仪（酶标仪）比色测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软

4、件，自动洗板、温育、加样450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm（六）类型酶免疫组织化学技术酶免疫测定均相酶免疫测定异相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定高敏感、高特异，几乎所有可溶性抗原抗体系统均可用该法检测(酶)免疫组织化学（免疫细胞化学）：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定性、定位、定量测定的技术。免疫反应特异性组织化学的可见性二、酶免疫组织化学技术EnzymeImmunohistochemistryTechniq

5、ue（EIHCT）免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于荧光免疫组化技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的酶免疫组化技术。荧光免疫组化技术局限性：荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清酶免疫组化技术：能克服上述不足，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。步骤：抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化标记抗体标本处理抗原抗体反应和呈色反应显微镜观察三、酶联免疫分析技术Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay

6、（ELISA）1971年瑞典学者Engvail和Perlmannn,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。简便、快速、敏感、特异、实验设备简单、应用范围广、无同位素污染（一）基本原理酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术。先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应加入酶标抗体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分最后加入酶反应底

7、物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。根据检测目的和操作步骤不同：双抗体夹心法间接法竞争法捕获法dot-ELISABAS-ELISA（二）类型双抗体夹心法此法常用于测定抗原，适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。双抗体夹心法间接法此法是测定抗体最常用的方法。间接法竟争法此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。此法用于血清中某种抗体亚型成分测定。以IgM测定为例：捕获法抗人IgMμ链抗体样本（IgM1、2）抗人IgMμ链抗体IgM1特异抗原（Ag1）抗人I

8、gMμ链抗体抗人IgMμ链抗体IgM2抗人IgMμ链抗体IgM1抗人IgMμ链抗体IgM2Ag1Ab1*E抗人IgMμ链抗体IgM1抗人IgMμ链抗体IgM2Ag1Ab1*E（三）技术要点1固相载体：与Ab或Ag有较高结合容量，结合稳定；可结合Ag